MOLECULAR CLONING, CHARACTERIZATION AND EXPRESSION ANALYSIS OF THE RBM20, A NOVEL RIBONUCLEOPROTEIN GENE ASSOCIATED TO FAMILIAL DILATED CARDIOMYOPATHY.

Lo splicing alternativo del pre-RNA messaggero (pre-mRNA) è un processo strettamente regolato che coinvolge lo spliceosoma e proteine di legame all’RNA che possono reprimere o attivare i siti di splicing selezionati. Oltre il 15% delle malattie genetiche umane sono state associate a mutazioni negli elementi di splicing agenti in cis, ma poche tra queste sono attribuibili a fattori agenti in trans che controllano lo splicing alternativo. Gli effetti di queste mutazioni che coinvolgono il macchinario di splicing basale e i regolatori dello splicing alternativo sono stati associati all’autismo, alla sclerosi laterale amiotrofica e al cancro. Nel cuore e nel muscolo scheletrico, lo splicing alternativo svolge un ruolo critico per la funzione muscolare. In entrambi i sistemi, le transizioni di splicing avvengono secondo delle vie temporali strettamente raggruppate, in cui sono coinvolte le stesse proteine. Un ruolo diretto dei regolatori dello splicing nelle patologie cardiache è stato dimostrato recentemente per due proteine con un motivo di legame all’RNA (RBM), RBM25 e RBM20. Lo studio sperimentale presentato in questa tesi è focalizzato sulla proteina RBM20. RBM20, proteina con un motivo di legame all’RNA di tipo 20, è un fattore agente in trans espresso preferenzialmente nel tessuto cardiaco, che regola lo splicing alternativo di geni aventi un ruolo chiave nella funzionalità cardiaca, compresi quelli che regolano l’omeostasi ionica, la biologia del sarcomero e la trasduzione del segnale. Mutazioni del gene RBM20 sono associate a cardiomiopatia dilatativa familiare e la maggior parte di queste altera i residui amminoacidici presenti nel dominio ricco in arginine e serine della proteina. I motivi funzionali della proteina RBM20 sono stati predetti attraverso l’omologia di sequenza, ma sono stati poco caratterizzati a livello funzionale. In questo studio è stato clonato il cDNA della isoforma cardiaca della proteina RBM20 umana e della corrispondente proteina murina. L’utilizzo di vettori di espressione della proteina RBM20 prodotti nel corso dello studio ha contribuito alla caratterizzazione funzionale dei domini richiesti per la localizzazione nucleare di RBM20. Analisi di microscopia confocale hanno mostrato che RBM20 ha una localizzazione nucleare con distribuzione punteggiata a livello di strutture denominate “nuclear speckles”, questa distribuzione è tipica dei fattori di splicing con un dominio ricco in arginine e serine (RS). Attraverso la produzione di vettori che esprimono forme tronche della proteina e comparando la loro distribuzione subcellulare abbiamo identificato le sequenze necessarie alla localizzazione nucleare di RBM20. Questa regione comprende il dominio di legame all’RNA e il dominio ricco in arginine e serine. La sequenza è conservata in molte specie che appartengono solo alle proteine ortologhe di RBM20. Questi studi dimostrano l’esistenza di una selezione specifica durante l’evoluzione nella regolazione post-trascrizionale del cuore, indicando RBM20 come un fattore chiave negli eventi di regolazione dello splicing richiesti per la funzione cardiaca.