SOD1 (Superoxide Dismutase isoform1) is an antioxidant enzyme, conserved in any organism, and involved in oxidative stress cell defense. There are 3 different SOD isoforms in the cell, but the main isoform is Cu-Zn SOD, or SOD1, located in the cytosol. In the last years, SOD1 studies are exponentially increasing, since it was found that this protein is involved in the motor neuron neurodegenerative disease, known as amyotrophic lateral sclerosis (ALS). In the cell, SOD1 carries out other functions in addition to the antioxidant one. In yeast S.cerevisise, it promotes the regulation of mitochondrial metabolism, repressing the oxidative respiration, when the yeast grow on fermentable carbon source, such as glucose. Recently, it was discovered a transcriptional function for SOD1 under oxidative stress condition. Respiratory metabolism takes place in the inner mitochondrial membrane. VDAC1 (Voltage Dependent Anion Channel) or porin, located in the outer mitochondrial membrane allows the exchange of ions and metabolites between cytosol and the inside of the organelle. S.cerevisiae survives the deletion of VDAC1 codifying gene (Δpor1), but it is unable to grow on not fermentable carbon source, such as glycerol, because it cannot perform the mitochondrial respiration. This defective growth can be restored by other eukaryotic porins, (like the human, murine and so on), since the protein is conserved in the evolution. In this work, we focused on the SOD1 role in VDAC1-related mitochondrial metabolism, to understand the relationships between both these proteins in the cell. The starting point of this work was serendipitous. The aim of the project was, at the beginning, to study the interaction between VDAC1 and hSOD1 wild type and hSOD1 mutant forms involved in ALS, after co-transformation of Δpor1 strain. Surprisingly the expression of hSOD1 in Δpor1 strain, an experimental control, showed a very interesting phenotype, with the recovery of the defective growth of mutant strain on not fermentative glycerol. Starting from this observation, we carried out the characterization of this strain. Especially, we investigated the mitochondrial functionality, and we demonstrated a recovery of mitochondrial metabolism and the increase of the outer mitochondrial membrane proteins gene expression in the presence of hSOD1. Among them, the por2 gene encoding the second isoform of VDAC (yVDAC2), resulted 8-times overexpressed in Δpor1 transformed with hSOD1, compared to control Δpor1. At the end, since yVDAC2 is a protein unknown until now, because it is expressed at very low level in the cell, we performed the electrophysiological characterization of yVDAC2 recombinant protein, highlighting its pore-forming activity. Moreover, the expression of hSOD1 protein in Δpor1 strain, provokes a remodeling of cell wall composition and structure.

La superossido dismutasi (SOD) è un enzima antiossidante, presente in tutti gli eucarioti, che svolge la funzione di difendere la cellula dall’anione superossido. Nonostante siano state descritte 3 isoforme diverse, la Cu-Zn SOD, o SOD1 è l’isoforma più abbondante nel citosol. Negli ultimi anni l’interesse verso lo studio di questa proteina è cresciuto sempre di più, dal momento che diverse mutazioni della proteina sono state ritrovate in tessuti di pazienti affetti da sclerosi laterale amiotrofica (SLA), una patologia neurodegenerativa, che colpisce i motoneuroni del sistema nervoso. Oltre alla funzione antiossidante, sono state descritte altre funzioni per la proteina SOD1. Nel lievito S.cerevisiae, SOD1 è coinvolta nella regolazione della repressione del metabolismo mitocondriale, in quanto la cellula che cresce su glucosio utilizza quasi esclusivamente la fermentazione per la produzione di energia, reprimendo la respirazione ossidativa. Inoltre recentemente è stato dimostrato che SOD1 può agire da attivatore della trascrizione di geni coinvolti nella difesa allo stress ossidativo e nella riparazione del DNA. Il metabolismo respirativo che avviene all’interno del mitocondrio, è in gran parte favorito dalla presenza della proteina VDAC1 (Voltage Dependent Anion Channel). Essa, localizzata sulla membrana mitocondriale esterna, assicura la sua permeabilità, favorendo gli scambi di metaboliti e ioni tra il mitocondrio e il citosol. In S.cerevisiae la delezione del gene che codifica per questa proteina (ceppo Δpor1) causa scompensi nella funzionalità del mitocondrio, a tal punto che la cellula non è più in grado di crescere e riprodursi utilizzando il glicerolo come fonte di carbonio, proprio perché non è in grado di effettuare la respirazione mitocondriale. Tale difetto, può essere recuperato dall’espressione eterologa di proteine omologhe appartenenti a specie diverse, tra cui quella umana, a conferma della conservazione della proteina durante il processo evolutivo. Alla luce delle evidenze descritte, in questo lavoro è stata posta l’attenzione sulla funzione che la SOD1 svolge all’interno del metabolismo mitocondriale mediato da VDAC1 per comprendere il delicato ruolo di cooperazione svolto dalle due proteine all’interno della cellula. È importante precisare l’origine e il modo con cui è stato ottenuto il ceppo protagonista di questa tesi di dottorato, ovvero il ceppo Δpor1 che esprime la proteina umana SOD1. Questo ceppo, era stato generato come il controllo di un esperimento in cui Δpor1 era stato trasformato contemporaneamente con le sequenze codificanti la proteina umana VDAC1 e la proteina SOD1 wild type o mutanti coinvolti nella SLA. Attraverso l’osservazione e lo studio del ceppo co-trasformato si voleva studiare l’effetto che le proteine SOD1 mutanti avevano sul metabolismo mitocondriale mediato da VDAC1, al fine di individuare una possibile interazione funzionale tra le due proteine. La successiva analisi fenotipica del ceppo controllo Δpor1 trasformato con hSOD1 umana ha permesso di osservare un’inattesa e sorprendente ripresa della crescita su glicerolo, che ha subito dato avvio alla ricerca del meccanismo coinvolto. Gli studi scaturiti, dimostrano che l’espressione di hSOD1 recupera la funzionalità mitocondriale del ceppo Δpor1, modulando l’espressione delle proteine della membrana mitocondriale esterna e incrementando la quantità dei mitocondri e le copie di mt-DNA. Tale ceppo, inoltre, presenta un caratteristico rimodellamento della struttura della parete cellulare, che la rende più resistente all’azione di agenti chimici. Infine è stata caratterizzata l’isoforma yVDAC2, risultata la più espressa tra le proteine β-barrel della membrana mitocondriale esterna nel ceppo Δpor1 trasformato con hSOD1. Questa proteina, ad oggi poco conosciuta, si è rivelata in grado di formare canali in membrane lipidiche artificiali seppur con qualche differenza rispetto all’isoforma principale yVDAC1.

Caratterizzazione del ruolo della Superossido Dismutasi 1 (SOD1) in relazione al metabolismo mitocondriale / DI ROSA, MARIA CARMELA. - (2018 Jan 29).

Caratterizzazione del ruolo della Superossido Dismutasi 1 (SOD1) in relazione al metabolismo mitocondriale

DI ROSA, MARIA CARMELA
2018-01-29

Abstract

La superossido dismutasi (SOD) è un enzima antiossidante, presente in tutti gli eucarioti, che svolge la funzione di difendere la cellula dall’anione superossido. Nonostante siano state descritte 3 isoforme diverse, la Cu-Zn SOD, o SOD1 è l’isoforma più abbondante nel citosol. Negli ultimi anni l’interesse verso lo studio di questa proteina è cresciuto sempre di più, dal momento che diverse mutazioni della proteina sono state ritrovate in tessuti di pazienti affetti da sclerosi laterale amiotrofica (SLA), una patologia neurodegenerativa, che colpisce i motoneuroni del sistema nervoso. Oltre alla funzione antiossidante, sono state descritte altre funzioni per la proteina SOD1. Nel lievito S.cerevisiae, SOD1 è coinvolta nella regolazione della repressione del metabolismo mitocondriale, in quanto la cellula che cresce su glucosio utilizza quasi esclusivamente la fermentazione per la produzione di energia, reprimendo la respirazione ossidativa. Inoltre recentemente è stato dimostrato che SOD1 può agire da attivatore della trascrizione di geni coinvolti nella difesa allo stress ossidativo e nella riparazione del DNA. Il metabolismo respirativo che avviene all’interno del mitocondrio, è in gran parte favorito dalla presenza della proteina VDAC1 (Voltage Dependent Anion Channel). Essa, localizzata sulla membrana mitocondriale esterna, assicura la sua permeabilità, favorendo gli scambi di metaboliti e ioni tra il mitocondrio e il citosol. In S.cerevisiae la delezione del gene che codifica per questa proteina (ceppo Δpor1) causa scompensi nella funzionalità del mitocondrio, a tal punto che la cellula non è più in grado di crescere e riprodursi utilizzando il glicerolo come fonte di carbonio, proprio perché non è in grado di effettuare la respirazione mitocondriale. Tale difetto, può essere recuperato dall’espressione eterologa di proteine omologhe appartenenti a specie diverse, tra cui quella umana, a conferma della conservazione della proteina durante il processo evolutivo. Alla luce delle evidenze descritte, in questo lavoro è stata posta l’attenzione sulla funzione che la SOD1 svolge all’interno del metabolismo mitocondriale mediato da VDAC1 per comprendere il delicato ruolo di cooperazione svolto dalle due proteine all’interno della cellula. È importante precisare l’origine e il modo con cui è stato ottenuto il ceppo protagonista di questa tesi di dottorato, ovvero il ceppo Δpor1 che esprime la proteina umana SOD1. Questo ceppo, era stato generato come il controllo di un esperimento in cui Δpor1 era stato trasformato contemporaneamente con le sequenze codificanti la proteina umana VDAC1 e la proteina SOD1 wild type o mutanti coinvolti nella SLA. Attraverso l’osservazione e lo studio del ceppo co-trasformato si voleva studiare l’effetto che le proteine SOD1 mutanti avevano sul metabolismo mitocondriale mediato da VDAC1, al fine di individuare una possibile interazione funzionale tra le due proteine. La successiva analisi fenotipica del ceppo controllo Δpor1 trasformato con hSOD1 umana ha permesso di osservare un’inattesa e sorprendente ripresa della crescita su glicerolo, che ha subito dato avvio alla ricerca del meccanismo coinvolto. Gli studi scaturiti, dimostrano che l’espressione di hSOD1 recupera la funzionalità mitocondriale del ceppo Δpor1, modulando l’espressione delle proteine della membrana mitocondriale esterna e incrementando la quantità dei mitocondri e le copie di mt-DNA. Tale ceppo, inoltre, presenta un caratteristico rimodellamento della struttura della parete cellulare, che la rende più resistente all’azione di agenti chimici. Infine è stata caratterizzata l’isoforma yVDAC2, risultata la più espressa tra le proteine β-barrel della membrana mitocondriale esterna nel ceppo Δpor1 trasformato con hSOD1. Questa proteina, ad oggi poco conosciuta, si è rivelata in grado di formare canali in membrane lipidiche artificiali seppur con qualche differenza rispetto all’isoforma principale yVDAC1.
SOD1 (Superoxide Dismutase isoform1) is an antioxidant enzyme, conserved in any organism, and involved in oxidative stress cell defense. There are 3 different SOD isoforms in the cell, but the main isoform is Cu-Zn SOD, or SOD1, located in the cytosol. In the last years, SOD1 studies are exponentially increasing, since it was found that this protein is involved in the motor neuron neurodegenerative disease, known as amyotrophic lateral sclerosis (ALS). In the cell, SOD1 carries out other functions in addition to the antioxidant one. In yeast S.cerevisise, it promotes the regulation of mitochondrial metabolism, repressing the oxidative respiration, when the yeast grow on fermentable carbon source, such as glucose. Recently, it was discovered a transcriptional function for SOD1 under oxidative stress condition. Respiratory metabolism takes place in the inner mitochondrial membrane. VDAC1 (Voltage Dependent Anion Channel) or porin, located in the outer mitochondrial membrane allows the exchange of ions and metabolites between cytosol and the inside of the organelle. S.cerevisiae survives the deletion of VDAC1 codifying gene (Δpor1), but it is unable to grow on not fermentable carbon source, such as glycerol, because it cannot perform the mitochondrial respiration. This defective growth can be restored by other eukaryotic porins, (like the human, murine and so on), since the protein is conserved in the evolution. In this work, we focused on the SOD1 role in VDAC1-related mitochondrial metabolism, to understand the relationships between both these proteins in the cell. The starting point of this work was serendipitous. The aim of the project was, at the beginning, to study the interaction between VDAC1 and hSOD1 wild type and hSOD1 mutant forms involved in ALS, after co-transformation of Δpor1 strain. Surprisingly the expression of hSOD1 in Δpor1 strain, an experimental control, showed a very interesting phenotype, with the recovery of the defective growth of mutant strain on not fermentative glycerol. Starting from this observation, we carried out the characterization of this strain. Especially, we investigated the mitochondrial functionality, and we demonstrated a recovery of mitochondrial metabolism and the increase of the outer mitochondrial membrane proteins gene expression in the presence of hSOD1. Among them, the por2 gene encoding the second isoform of VDAC (yVDAC2), resulted 8-times overexpressed in Δpor1 transformed with hSOD1, compared to control Δpor1. At the end, since yVDAC2 is a protein unknown until now, because it is expressed at very low level in the cell, we performed the electrophysiological characterization of yVDAC2 recombinant protein, highlighting its pore-forming activity. Moreover, the expression of hSOD1 protein in Δpor1 strain, provokes a remodeling of cell wall composition and structure.
S.cerevisiae, yeast, lievito, mitochondria, metabolism, respiration
Caratterizzazione del ruolo della Superossido Dismutasi 1 (SOD1) in relazione al metabolismo mitocondriale / DI ROSA, MARIA CARMELA. - (2018 Jan 29).
File in questo prodotto:
Non ci sono file associati a questo prodotto.

I documenti in IRIS sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.

Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: http://hdl.handle.net/20.500.11769/491026
Citazioni
  • ???jsp.display-item.citation.pmc??? ND
  • Scopus ND
  • ???jsp.display-item.citation.isi??? ND
social impact