Plasmonic Detection of microRNA Biomarkers in Microfluidic Devices for Brain Cancer Non-Invasive Diagnosis

Gliomas are aggressive brain tumours, causing a very low survival rate for patients, even after diagnosis. Developing a reliable, cheap, and non-invasive diagnostic technique with minimal side effects is one of the EU’s leading medical and societal challenges. Liquid biopsy has gained broad attention for detecting and characterising circulating biomarkers as circulating microRNAs, which expression levels can be correlated to a significant variety of diseases. The drawbacks of conventional microRNA detection methods can be overcome by applying the technology of biosensor platforms. In particular, Surface Plasmon Resonance Imaging (SPRi) biosensors allow a rapid, highly-sensitive and selective detection of microRNAs in real-time, without the need for labels. This PhD thesis aimed for the plasmonic detection of microRNA biomarkers in microfluidic devices for brain cancer non-invasive diagnosis. A microRNA detection assay was implemented by designing neutrally charged peptide nucleic acid (PNA) surface probes complementary to target microRNAs. Successful surface immobilisation of these PNA probes and hybridisation of target microRNA was significantly improved by adding magnesium ions to the buffer, depositing a positive charge to the sensor surface facilitating the attraction of negatively charged microRNA to the sensor surface. An extensive melting curve study confirmed this hypothesis and ruled out a PNA and microRNA duplex stabilisation in solution (results in accordance with literature reporting on interactions independent of ionic strength). Furthermore, an ultrasensitive microRNA detection in pooled human serum and glioma patient samples was realised. For signal enhancement, a gold nanoparticle enhanced assay was implemented to detect microRNA concentrations in human serum in the femtomolar range. Finally, isothermal circular strand displacement polymerisation (ICSDP) was investigated to allow PCR-free amplification of low target concentrations. After a successful proof-of-concept study in solution, the assay was transferred to the SPRi biosensor platform, where different surface chemistries have been investigated. Even if the actual amplification step was unsuccessful, this work provides an essential basis for further studies.

I gliomi sono tumori cerebrali aggressivi che causano un tasso di sopravvivenza molto basso per i pazienti, anche dopo la diagnosi. Lo sviluppo di una tecnica diagnostica affidabile, economica e non invasiva con effetti collaterali minimi, è una delle principali sfide mediche e sociali dell'UE. La biopsia liquida ha guadagnato molta attenzione per il rilevamento e caratterizzazione di biomarcatori circolanti, come microRNA circolanti, i cui livelli di espressione possono essere correlati a una significativa varietà di malattie. Gli svantaggi dei metodi convenzionali di rilevamento dei microRNA possono essere superati applicando la tecnologia delle piattaforme di biosensori. In particolare, i biosensori di risonanza plasmonica di superficie per immagini (SPRi, dal suo acronimo in inglese) consentono un rilevamento rapido, altamente sensibile e selettivo dei microRNA in tempo reale, senza la necessità di etichette. Questa tesi di dottorato ha come scopo la rilevazione plasmonica di biomarcatori microRNA in dispositivi microfluidici per la diagnosi non invasiva del cancro al cervello. È stato implementato un test di rilevamento di microRNA, selezionando una sonda di superficie di acido nucleico peptidico (PNA, dal suo acronimo in inglese) a carica neutra e complementare per legare microRNA. L'immobilizzazione superficiale di queste sonde di PNA e l'ibridazione del microRNA obiettivo sono state notevolmente migliorate aggiungendo ioni di magnesio al buffer, depositando una carica positiva sulla superficie del sensore, facilitando l'attrazione di microRNA con carica negativa sulla superficie del sensore. Un ampio studio sulla curva di fusione ha confermato questa ipotesi e ha escluso una stabilizzazione duplex di PNA e microRNA in soluzione (risultati in accordo con la letteratura che riporta le interazioni indipendenti dalla forza ionica). Inoltre, è stato realizzato un rilevamento ultrasensibile di microRNA in campioni di pool di siero umano e pazienti con glioma. Per il miglioramento del segnale, è stato implementato un test potenziato con nanoparticelle d'oro per rilevare le concentrazioni di microRNA nel siero umano nell'intervallo femtomolare. Infine, la polimerizzazione isotermica a spostamento del filamento circolare (ICSDP, dal suo acronimo in inglese) è stato studiato per consentire l'amplificazione senza PCR di obiettivo a basse concentrazioni. Dopo uno studio riuscito della verifica teorica in soluzione, il test è stato trasferito alla piattaforma di biosensori SPRi, dove sono state studiate diverse sostanze chimiche di superficie. Anche se la fase di amplificazione non ha avuto successo, questo lavoro fornisce una base essenziale per ulteriori studi.