Ruolo dell'Eme Ossigenasi nelle malattie correlate alla sindrome metabolica

Several hundred million people throughout the world have the metabolic syndrome (MetS), a cluster of metabolic and cardiovascular disorders. Obesity is one of the main underlying risk factors for the metabolic syndrome. The increasing prevalence of obesity and the metabolic syndrome is alarming because they increase the risk of type 2 diabetes, liver disease, cardiovascular disease and premature mortality. Adipose tissue is a key player in whole body metabolism and excess adipose tissue poses a major risk factor for the development of metabolic disorders. In response to nutritional overload, de novo adipocyte differentiation can serve as an adaptive mechanism by increasing the storage capacity of adipose tissue and maintaining normal adipocyte function. This in turn prevents systemic lipid overload, insulin resistance and low grade systemic inflammation, which are the major cause of Non alcoholic fatty liver disease. This PhD thesis is focused on Heme Oxygenase, an important antioxidant enzymatic system involved in many physiological and pathophysiological processes, and provides novel insights of its role into the regulation of adipogenesis, insulin resistance and hepatic lipid metabolism. Chapter 2 describes the effect of N-acetylcysteine (NAC), a powerful antioxidant and precursor of glutathione, commonly used to treat chronic obstructive pulmonary disease, on triglycerides accumulation in bone marrow stromal cells-derived adipocytes. Adipocytes were treated with a fatty acids overload, miming obesity condition, and NAC that increased adiponectin, HO-1 and beta-oxidation markers, ameliorating the impaired adipocytes functions. Chapter 3 investigate if the potentially protective effect of phenethyl ester of caffeic acid (CAPE), one of the main components of propolis with a flavonoid-like structure, and of a novel CAPE analogue, as heme oxygenase-1 (HO-1) inducers, could reduce pancreatic oxidative damage induced by excessive amount of glucose, affecting the nitric oxide synthase/dimethylarginine dimethylaminohydrolase (NOS/DDAH) pathway in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. The resulted showed as HO-1 inducers such as CAPE or its more potent derivatives may be useful in diabetes, counteracting the high glucose-derived oxidative stress. Chapter 4 explores the effect of Olive leaf extract (OLE) from Sicilian cultivar in an in vitro model of hepatic steatosis to evaluate the protective effects again free fatty acids accumulation in hepatocytes. OLE treatment showed to induce HO-1 expression, decrease inflammation markers levels and increase mRNA levels of FABP-4 and SIRT1, two proteins involved in lipid metabolism, with a parallel decrease in number of lipid droplets. Chapter 5 analyzed the effects of HO-1 activity inhibition on lipid metabolism and fibrosis process in two in vitro models of hepatic cells. The first model was create treating HepG2 cells with free fatty acids to induce steatosis, in presence or absence of the powerful HO-1 activity inhibitor SnMP alone or in combination with the HO-1 expression inducer CoPP. The OIL RED staining as well as the expression of lipid metabolism proteins showed that HO-1 activity inhibition exacerbates hepatocytes steatosis, while in the co-treatment with the CoPP these results were reversed. A similar trend was obtained with the hepatic fibrosis model, where the TGF-B activated-LX2 cells showed to release more collagen in presence of SnMP alone, demonstrating that HO-1 activity have a pivotal role in both stesosis and fibrosis processes. Chapter 6 explores how metabolic abnormalities in NASH are driven by decreases in hepatic HO-1 that is associated with an increase in the adipose-derived pro-inflammatory adipokine NOV in this obese mouse model of NASH. Concurrently, induction of HO-1 provides protection against insulin resistance as seen by the increases in insulin receptor phosphorylation. Chapter 7 describes the central role of EET-A in attenuation of obesity-induced steatosis and hepatic fibrosis that leads to NAFLD. EET-A intervention diminishes fatty acid accumulation, fibrosis, and NAFLD associated with an increase in HO-1-PGC1α and increased insulin receptor phosphorylation. Chapter 8 explores the effects of soluble epoxide hydrolase (sEH) deletion on various aspects of adipocyte-function, including programing for white vs. beige-like fat, and mitochondrial and thermogenic gene-expressions. sEH deletion results in a significant increase in EETs with a consequent decrease in adipocyte size, inflammatory adipokines NOV, TNFα, and an increase in adiponectin. Notably, activation of HO-1 gene expression further increased the levels of EETs, suggesting that the antioxidant HO-1 system protects EETs from degradation by ROS. Chapter 9 investigate the Thymoquinone effects in obese mice model. The TQ attenuated the obesity-mediated decrease of oxygen consumption, improved mitochondrial biogenesis and through increased levels of HO-1 decreased the HF-induced OX-LDL. Chapter 10 describes the preliminary data of a cross-talk effect between adipose tissue and liver in an obese mice model. The selective adipose tissue overexpression of HO-1, or HO-1+PGC-1a, showed to increase the key metabolism regulator proteins expression in the liver, while decreased inflammation cytokine NOV and fatty acid synthesis. Chapter 11 summerize all the PhD thesis finding that taken together, provides new evidences that identifies the enzyme Heme Oxygenase as a key protein in metabolic homeostasis, preventing systemic lipid overload, insulin resistance and decreasing inflammation. Consequently, increase of HO-1 levels may provide a therapeutic approach to address the metabolic alterations associated with Diabetes type 2, obesity and NAFLD.

Diverse centinaia di milioni di persone in tutto il mondo sono affetti dalla sindrome metabolica (MetS), una condizione caratterizzata dalla copresenza di diversi disturbi metabolici e cardiovascolari. L'obesità rappresenta uno dei principali fattori di rischio per lo sviluppo di questa sindrome, cosi come di malattie ad essa correlate quali il diabete di tipo 2, malattie epatiche e cardiovascolari. Il tessuto adiposo è un elemento chiave nel metabolismo dell'intero corpo e l'eccesso di tessuto adiposo può contribuire in maniera importante allo sviluppo di disturbi metabolici. In risposta al sovraccarico nutrizionale, la differenziazione de novo degli adipociti può servire come meccanismo adattivo, aumentando la capacità di stoccaggio del tessuto adiposo e mantenendo la normale funzione degli adipociti, prevenendo il sovraccarico lipidico sistemico, l'insulino-resistenza e l'infiammazione sistemica di basso grado, che sono la principale causa di malattia del fegato grasso non alcolico (NAFLD). Questa tesi di dottorato è incentrata sull’Eme Ossigenasi, un importante sistema enzimatico antiossidante coinvolto in molti processi fisiologici e patologici, fornendo nuove intuizioni sul suo ruolo nella regolazione dell'adipogenesi, dell'insulino-resistenza e nel metabolismo dei lipidi epatici. Il capitolo 2 descrive l'effetto di N-acetylcysteine (NAC), un potente antiossidante e precursore del glutatione comunemente usato per trattare la malattia polmonare ostruttiva cronica, sull'accumulo di trigliceridi negli adipociti derivati dalle cellule stromali del midollo osseo. Gli adipociti sono stati trattati con un sovraccarico di acidi grassi, in modo da simulare in vitro una condizione di obesità, e il NAC, che ha aumentato i livelli di adiponectina, HO-1 ed i livelli di espressione dei marcatori della beta-ossidazione, ripristinando la funzionalità degli adipociti alterati. Il capitolo 3 indaga sull'effetto potenzialmente protettivo dell'estere feniletilico dell'acido caffeico (CAPE), uno dei principali componenti della propoli con una struttura simile ad un flavonoide, e di un nuovo analogo CAPE, come induttori dell’eme ossigenasi-1 (HO-1) usati come trattamento in ratti con diabete di tipo 1 indotto da streptozotocina. Le sostanze hanno mostrato di ridurre il danno ossidativo pancreatico indotto dall’eccesso di glucosio, che colpisce la sintetasi dell’ossido nitrico/Dimetilarginina Dimetilaminoidrolasi (NOS/DDAH), mostrando come induttori di HO-1 come il CAPE o i suoi derivati più potenti, possono essere utili nella terapia del diabete. Il capitolo 4 esplora l'effetto dell'estratto di foglie d'oliva (OLE) di una cultivar siciliana in un modello in vitro di steatosi epatica, per valutarne gli effetti protettivi sull'accumulo di acidi grassi liberi negli epatociti. Il trattamento OLE ha mostrato di indurre l'espressione di HO-1, diminuire i livelli dei marcatori di infiammazione e aumentare i livelli di mRNA di FABP-4 e SIRT1, due proteine coinvolte nel metabolismo dei lipidi, con una diminuzione parallela nel numero di goccioline lipidiche. Il capitolo 5 ha analizzato gli effetti dell'inibizione dell'attività HO-1 sul metabolismo dei lipidi e sul processo di fibrosi in due modelli in vitro di cellule epatiche. Il primo modello è stato creato trattando delle cellule HepG2 con acidi grassi liberi per indurre la steatosi, in presenza o assenza del potente inibitore dell'attività HO-1 denominato SnMP, da solo o in combinazione con un induttore di HO-1, il CoPP. La colorazione OIL RED O dei trigliceridi e l'espressione delle proteine del metabolismo dei lipidi hanno mostrato che l'inibizione dell'attività HO-1 aggrava la steatosi epatica, mentre nel caso di co-trattamento con il CoPP si sono ottenuti risultati opposti. Una tendenza simile è stata riscontrata anche con il modello di fibrosi epatica, dove le cellule epatiche stellate LX2, attivate dal TGF-B, hanno mostrato di rilasciare più collagene in presenza di SnMP. Questi risultati hanno dimostrato che l'attività di HO-1 ha un ruolo fondamentale nei processi di steatosi e fibrosi. Il capitolo 6 esplora come le anomalie metaboliche nella NASH siano guidate dalla diminuzione dei livelli di HO-1 epatici, in associazione con un aumento del rilascio dell’adipokina pro-infiammatoria NOV da parte del tessuto adiposo, sfruttando un modello murino obeso di NASH. Allo stesso tempo, l'induzione di HO-1 fornisce protezione contro l'insulino-resistenza, come visto dall'aumento della fosforilazione del recettore dell'insulina. Il capitolo 7 descrive l’importante ruolo dell'EET-A nel migliorare le condizione che caratterizzano la NAFLD. La somministrazione di EET-A ha ridotto l'accumulo di acidi grassi e la fibrosi epatica, potenziando l’asse HO-1-PGC1-a ed aumentando la sensibilità all’insulina. Il capitolo 8 indaga gli effetti della delezione della soluble epoxide hydrolase (sEH) sui vari aspetti della funzionalità adipocitaria, incluso il controllo della transdifferenziazione tra il grasso bianco e beige, analizzando le espressioni geniche di proteine mitocondriali e della termogenesi. La delezione della sEH ha comportato un aumento significativo degli EETs, con una conseguente diminuzione delle dimensioni degli adipociti e dei livelli delle adipochine pro-infiammatorie NOV e TNF-a, e un aumento dell’adiponectina. In particolare, l’induzione dell'espressione genica di HO-1 ha ulteriormente aumentato i livelli di EET, suggerendo che il sistema antiossidante HO-1 protegge gli EET dalla degradazione da parte del ROS. Capitolo 9 mostra gli effetti del timoquinone (TQ) su un modello di topi obesi. Il TQ ha attenuato la diminuzione del consumo di ossigeno che caratterizza lo stato di obesità, ha migliorato la biogenesi mitocondriale ed attraverso l'aumento dei livelli di HO-1 ha ridotto l’ossidazione delle LDL indotta da dieta grassa. Il capitolo 10 descrive i dati preliminari di un effetto di cross-talk tra tessuto adiposo e fegato in un modello di topi obesi. La sovraespressione selettiva nel tessuto adiposo di HO-1, o HO-1 e PGC-1a, ha mostrato di aumentare l'espressione delle proteine regolatrici del metabolismo epatico, diminuendo la sintesi degli acidi grassi e i livelli della proteina pro-infiammatoria NOV. Il capitolo 11 raggruppa ed elabora le conclusioni derivanti dai capitoli precedenti della tesi di dottorato, fornendo nuove prove che identificano l'enzima Eme Ossigenasi come una proteina chiave nell'omeostasi metabolica, capace di prevenire il sovraccarico sistemico di lipidi, l'insulino-resistenza e di ridurre l'infiammazione. Di conseguenza, l'aumento dei livelli di HO-1 possono rappresentare un approccio terapeutico per affrontare le alterazioni metaboliche associate al diabete di tipo 2, all’obesità e alla NAFLD.