STRATEGIE DI COLTURA PER L'INDUZIONE NEUROGENICA DI CELLULE STAMINALI DERIVATE DAL TESSUTO ADIPOSO. INFLUENZA DELLA MELATONINA.

The ability of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) to differentiate in several cell lines has been extensively investigated in the last decades in order to develop therapeutic strategies in the field of cell-based regenerative medicine. MSCs from bone marrow have been the first to be identified and studied. Successively, many other sources have been successfully tested. Adipose-derived MSCs (ASCs) have been lately more investigated since they feature several advantages. They can be easily obtained with minimally invasive procedures, such us liposuction; they are characterized by a higher cell yield; they show higher proliferation rate and differentiation ability; they can be readily available for autologous applications. In this PhD thesis, the ability of ASCs to differentiate toward a neural phenotype has been investigated. A neural differentiation of ASCs is of particular interest for future treatments of traumatic or degenerative diseases affecting the nervous system, in which repair mechanisms are not efficient. In fact, only a limited amount of neural stem cells reside in the brain and their restricted localization cannot ensure a satisfactory recovery in case of injured or dead neural cells. To induce a neural differentiation of ASCs, instead of supplementing the culture medium with potentially toxic chemical molecules, the use of conditioned media derived from glial cell was preferred. In this way, the culture medium contains several cytokines/growth factors and more closely mimic the physiological composition of a neural microenvironment in vivo. In particular, conditioned media from Olfactory Ensheathing Cells or Schwann Cells were used. In additional experiments, the effects of melatonin were also investigated, since it has been reported that this hormone can improve cell growth and differentiation of neural stem cells. Results were obtained by immunofluorescence protocols and flow cytometry analysis. The modification of typical neural markers and connexins were observed. Overall, it has been found that the protocol adopted has provided successful outcomes. In fact, a variety of neuronal and glial markers were overexpressed after a few days of treatment (3-6 days). At the same time, a typical neural pattern of connexin expression could be induced. These modifications were earlier induced when melatonin was added to the culture medium. The interaction with Melatonin receptor 1 was likely responsible for these effects. In conclusion, results obtained in the present investigations contribute to elucidate effects of molecules, normally present in the physiological environment, on ASC differentiation toward a neural-like phenotype. It is reasonable to expect that more studies will provide further information useful for developing stem cell therapeutic application in case of nervous system damage, to restore disease-disrupted brain circuitry.

La capacità delle cellule staminali mesenchimali (MSC) di differenziarsi in diverse linee cellulari è stata ampiamente studiata negli ultimi decenni al fine di sviluppare strategie terapeutiche nel campo della medicina rigenerativa. Le MSC del midollo osseo sono state le prime ad essere identificate e studiate. Successivamente, molte altre fonti sono state esplorate con successo. Le MSC di derivazione adiposa (ASC) sono state recentemente studiate maggiormente poiché presentano numerosi vantaggi. Possono essere facilmente ottenute con procedure minimamente invasive, come la liposuzione; sono caratterizzate da una maggiore resa cellulare; mostrano un più alto tasso di proliferazione e capacità di differenziamento; possono essere prontamente disponibili per applicazioni autologhe. In questa tesi di dottorato, è stata studiata la capacità delle ASC di differenziarsi verso un fenotipo neurale. Un differenziamento neurale delle ASC è di particolare interesse per i futuri trattamenti delle malattie traumatiche o degenerative che colpiscono il sistema nervoso, in cui i meccanismi di riparazione non sono efficienti. Infatti, solo una quantità limitata di cellule staminali neurali risiede nel cervello e la loro localizzazione limitata non può garantire un recupero soddisfacente in caso di cellule neurali danneggiate o morte. Per indurre un differenziamento neurale delle ASC, invece di integrare il terreno di coltura con sostanze chimiche potenzialmente tossiche, è stato preferito l'uso di terreni condizionati derivati da cellule gliali. In questo modo, il terreno di coltura contiene diverse citochine/fattori di crescita e imita più da vicino la composizione fisiologica di un microambiente neurale in vivo. In particolare, sono stati utilizzati terreni condizionati da cellule mielinizzanti olfattive o da cellule di Schwann. In ulteriori esperimenti, sono stati studiati anche gli effetti della melatonina, poiché è stato riportato che questo ormone può migliorare la crescita cellulare e il differenziamento delle cellule staminali neurali. I risultati sono stati ottenuti mediante protocolli di immunofluorescenza e analisi citofluorimetrica. Sono state osservate le variazioni dell’espressione fenotipica di tipici marcatori neurali e diverse connessine. Nel complesso, è stato riscontrato che il protocollo adottato ha fornito risultati positivi. In effetti, una varietà di marcatori neuronali e gliali sono stati maggiormente espressi dopo alcuni giorni di trattamento (3-6 giorni). Parimenti, poteva essere maggiormente indotta l’espressione di tipiche connessione neurali. Queste variazioni potevano essere indotte più precocemente quando la melatonina era aggiunta al terreno di coltura. L'interazione con il recettore 1 della melatonina era probabilmente responsabile di questi effetti. In conclusione, i risultati ottenuti nelle presenti indagini contribuiscono a chiarire gli effetti di molecole, normalmente presenti nell'ambiente fisiologico, sul differenziamento delle ASC verso un fenotipo neurale. È ragionevole aspettarsi che successivi studi forniranno ulteriori informazioni utili per lo sviluppo di applicazioni terapeutiche delle cellule staminali in caso di danni al sistema nervoso, per ripristinare i circuiti cerebrali danneggiati dalla malattia.