CODING E NON-CODING RNA COME BIOMARCATORI DI SEVERITA’ DI NAFLD E DI FIBROSI

In patients with non‐alcoholic fatty liver disease (NAFLD), liver biopsy is the gold standard to detect non‐alcoholic steatohepatitis (NASH) and stage liver fibrosis. We aimed to identify differentially expressed mRNAs and non‐coding RNAs in serum samples of biopsy‐diagnosed mild and severe NAFLD patients with respect to controls and to each other. We first performed a whole transcriptome analysis through microarray (n = 12: four Control: CTRL; four mild NAFLD: NAS ≤ 4 F0; four severe NAFLD NAS ≥ 5 F3), followed by validation of selected transcripts through real‐time PCRs in an independent internal cohort of 88 subjects (63 NAFLD, 25 CTRL) and in an external cohort of 50 NAFLD patients. A similar analysis was also performed on liver biopsies and HepG2 cells exposed to oleate:palmitate or only palmitate (cellular model of NAFL/NASH) at intracellular/extracellular levels. Transcript correlation with histological/clinical data was also analysed. We identified several differentially expressed coding/non‐coding RNAs in each group of the study cohort. We validated the up‐regulation of UBE2V1, BNIP3L mRNAs, RP11‐128N14.5 lncRNA, TGFB2/TGFB2‐OT1 coding/lncRNA in patients with NAS ≥ 5 (vs NAS ≤ 4) and the up‐regulation of HBA2 mRNA, TGFB2/TGFB2‐OT1 coding/lncRNA in patients with Fibrosis stages = 3‐4 (vs F = 0‐2). In in vitro models: UBE2V1, RP11‐128N14.5 and TGFB2/TGFB2‐OT1 had an increasing expression trend ranging from CTRL to oleate:palmitate or only palmitate‐treated cells both at intracellular and extracellular level, while BNIP3L was up‐regulated only at extracellular level. UBE2V1, RP11‐128N14.5, TGFB2/TGFB2‐OT1 and HBA2 up‐regulation was also observed at histological level. UBE2V1, RP11‐128N14.5, BNIP3L and TGFB2/TGFB2‐OT1 correlated with histological/biochemical data. Combinations of TGFB2/TGFB2‐OT1 + Fibrosis Index based on the four factors (FIB‐4) showed an Area Under the Curve (AUC) of 0.891 (P = 3.00E‐06) or TGFB2/TGFB2‐OT1 + Fibroscan (AUC = 0.892, P = 2.00E‐06) improved the detection of F = 3‐4 with respect to F = 0‐2 fibrosis stages. We identified specific serum coding/non‐coding RNA profiles in severe and mild NAFLD patients that possibly mirror the molecular mechanisms underlying NAFLD progression towards NASH/fibrosis. TGFB2/TGFB2‐OT1 detection improves FIB‐4/Fibroscan diagnostic performance for advanced fibrosis discrimination.

La steatosi epatica non alcolica (Non-Alcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD) è l’epatopatia cronica più comune nei paesi industrializzati con una prevalenza del 20-30% nella popolazione generale. La NAFLD comprende un vasto spettro di patologie epatiche e sebbene sia generalmente considerata una condizione benigna, essa può progredire verso la steatoepatite (Non Alcoholic SteatoHepatitis, NASH) che rappresenta il punto critico di evoluzione verso ulteriori stadi della NAFLD, tra cui la fibrosi, la cirrosi ed infine l'epatocarcinoma. Attualmente non esiste alcun sistema non invasivo che permetta di ottenere una diagnosi chiara ed univoca di NASH e di stadiare il livello di fibrosi. La biopsia epatica rimane dunque il gold standard per la diagnosi definitiva di NAFLD e per la stadiazione della fibrosi. A causa dei rischi connessi alla biopsia epatica ed all'impossibilità di applicarla su larga scala, è di estrema importanza l'identificazione di nuovi biomarcatori non invasivi che possano discriminare i pazienti ad alto rischio di progressione. Ad oggi non sono presenti in letteratura dati riguardanti l'alterazione del profilo di espressione dei coding e dei non-coding RNA nel siero di pazienti con NAFLD rispetto a soggetti di controllo. A tale scopo abbiamo eseguito un'analisi dell'intero trascrittoma espresso nel siero di pazienti mild NAFLD (NAS score ≤4; F=0), severe NAFLD (NAS score ≥5; F=3) e soggetti di controllo. Attraverso analisi computazionali abbiamo verificato il coinvolgimento dei coding e dei non-coding RNA differenzialmente espressi identificati in pathway associate alla fisiopatogenesi della NASH e della fibrosi. Abbiamo analizzato e confermato l’espressione di un set di coding e di non-coding RNA (UBE2V1, BNIP3L, RP11-128N14.5, TGFB2/TGFB2-OT1 e sherveebu) differenzialmente espressi tramite Single Real Time PCR in una coorte interna indipendente ed in una coorte esterna di pazienti con NAFLD. I dati d’espressione di tali trascritti sono stati analizzati anche nelle biopsie epatiche (n=12: 4 CTRL, 4 mild NAFLD, 4 severe NAFLD) e nelle cellule HepG2 esposte ad una miscela di oleato e palmitato o solo palmitato (modello cellulare di NAFL/NASH) sia a livello intracellulare che extracellulare. Abbiamo, inoltre, osservato che i valori relativi ai dati d’espressione dei trascritti validati erano associati attraverso una relazione di regressione lineare sia con i marker biochimici di routine, sia con i marker istologici utilizzati nella pratica clinica per diagnosticare e stadiare la NAFLD e la fibrosi. Infine, abbiamo valutato il potere diagnostico dei trascritti validati attraverso l’analisi delle curve ROC ed in particolare abbiamo osservato che la combinazione di TGFB2/TGFB2-OT1 con il Fibrosis-4 Index o con la Liver Stiffness Measurement era in grado di migliorare l’identificazione dei pazienti con fibrosi F 3-4 rispetto a quelli con fibrosi F 0-2. Il nostro studio fornisce nuovi dati high-throughput sull’espressione dei coding e dei non-coding RNA nel siero di pazienti con NAFLD e pone le basi per l'identificazione di nuovi biomarcatori come alternative future alla biopsia epatica.