La proteina tau a localizzazione nucleare quale marcatore molecolare precoce della malattia di Alzheimer.

Tau is a multifunctional protein, originally identified as a cytoplasmic protein associated with microtubules, it is characterized by a complex pattern of phosphorylation and is localised in the cytoplasm and nucleus in both neuronal and non-neuronal cells. It is codified by the MAPT gene (Microtubule-Associated Protein Tau), and the alternative splicing, in the neuronal cells, results in six different isoforms, whose size varies from 352 to 441 amino acid residues, differentially expressed during human brain development and present numerous potential phosphorylation sites that modulate their properties. Nuclear and nucleolar tau isoforms seem to play a protective role against DNA and RNA from damage events such as oxidative and thermal stress, also suggesting its potential role in ribosome biosynthesis and / or in the organization of genes for rRNA. Tau protein has a central role in Alzheimer's disease, where it is characterized by an high number of phosphorylations that bring to the development of "Paired Helical Filaments" (PHFs) representing the "core" of the "NeuroFibrillary Tangles" (NFTs). However, even today, there aren't early diagnostic methods for Alzheimer's disease. Literature data and preliminary data obtained in our Genetics laboratory indicate that the nucleolar tau protein may play a role in the early events of Alzheimer's disease, with a mechanism that would involve a probably direct interaction with the DNA and / or the RNA in the nucleolus. My research's aim has been to study the role of the nuclear tau protein in the onset of Alzheimer's disease and in cellular aging, to evaluate its possible use as an early molecular marker of AD. The experimental activity was performed using the human neuroblastoma cell line SK-N-BE, whose cells are comparable to neuroblasts, that can differentiate into neuronal-like cells by retinoic acid induction. Furthermore, hippocampal sections of human brain tissue, of individuals at various ages and at various stages of AD were used. The tissue sections were provided by the "University Alfonso X El Sabio" and by the pathology department of the "Fundación Alcorcón University Hospital" in Madrid. The results obtained in SK-N-BE cell line showed the presence of the smallest tau isoform, defined as 0N3R and composed of 352 amino acid residues. This isoform was then analyzed both in SK-N-BE cell line and in neurons of the hippocampal dentate gyrus and CA1 region. In detail, nuclear tau protein with phosphorylations in its main amino acid sites for the possible tau-DNA interaction was studied. These regions of interest are the PRD (Prolin rich domain) and MTBD (Microtubule binding domain), where are located the phosphorylated epitopes AT8, AT100, T181 and S262, and without phosphorylation Tau-1 respectively. The phosphoepitope AT100, which recognizes the phosphorylated Thr212/Ser214 residues, progressively increases in the nucleus (in particular in the nucleolus) of neurons from the youngest to the senile brain, showing that it may play a role in chromatin's protection. This protection could gradually decrease with cellular aging, or quickly by tau alteration, such as in Alzheimer's disease. AT100 epitope can be considered as a molecular marker of neuronal aging and its disappearance from the nucleus could be a signal of the onset of AD. The AT8 and Tau-1 epitopes localisation, corresponding to pSer202/pThr205 and Pro189/Gly207 regions respectively, has shown that, this part of tau is probably involved in the protein's conformational changes and that the presence/absence of phosphorylation is related to the nucleolus and cell differentiation functionality. Tau-1 appears in the nucleolus of both replicative and differentiated cells, while AT8 is detected only in the differentiated cells, in the entire nucleolar compartment. Moreover, in the replicative cells treated with actinomycin-D (transcriptional inhibitor of the RNA pol-I), AT8 is shown in the nucleolus, and together with Tau-1, it is located in the nucleolar periphery, where both colocalize with nucleolar transcription factor UBTF. These results, obtained also on PHA-induced lymphocytes, indicate that Tau-1 may be involved in the organization and/or expression of rRNA genes, helping UBTF in the binding of rDNA. The AT8 epitope, that in the nucleolus may be related to transcriptional inactivation of the rRNA genes, could be a marker of the neuronal differentiation and a regulator of nucleolus activity. The AT8 and Tau-1 epitopes localisation, in human hippocampus of individuals of various ages (from fetal brain to senile brain) and various stages of AD has shown that, in pyramidal neurons' nucleoli from CA1 region, AT8 gradually disappears in old age as well as is absent in the replicative SK-N-BE cells. Its disappearance, in a significant number of neurons from senile and AD brain, seems to indicate that cells re-entry, or preparing to re-entry, in replicative state. However, this process probably does not proceed over, inducing neuron's death and this could be one of the early events of disease.

La proteina tau è una proteina multifunzionale originariamente identificata come una proteina citoplasmatica associata ai microtubuli, caratterizzata da un complesso pattern di fosforilazioni e localizzata nel citoplasma e nel nucleo di cellule neuronali e non neuronali. Il gene che codifica per tale proteina è il gene MAPT (Microtubule-Associated Protein Tau) che mediante splicing alternativo codifica per 6 differenti isoforme di TAU, le cui dimensioni variano da 352 a 441 residui aminoacidici, differenzialmente espresse durante lo sviluppo del cervello umano e presentano numerosi potenziali siti di fosforilazione che ne modulano le proprietà. Le isoforme di tau a localizzazione nucleare e nucleolare sembrano svolgere un ruolo protettivo nei confronti di DNA ed RNA da eventi di danno come stress ossidativo e termico, suggerendo anche un potenziale ruolo della proteina tau nella biosintesi dei ribosomi e/o nell’organizzazione dei geni per gli rRNA. La proteina tau riveste un ruolo centrale nella malattia di Alzheimer, dove si presenta con elevato numero di fosforilazioni costituendo i cosiddetti “Paired Helical Filaments” (PHFs) che rappresentano il “core” dei “NeuroFibrillary Tangles” (NFTs), caratteristici della malattia. Tuttavia, ancora oggi, non esistono metodi diagnostici precoci per la malattia di Alzheimer. Dati di letteratura e dati preliminari ottenuti nel nostro laboratorio di Genetica indicano che la proteina tau a localizzazione nucleolare possa avere un ruolo negli eventi precoci dell’AD, con un meccanismo che implicherebbe un’interazione, probabilmente diretta, con il DNA e/o l'RNA presente nel nucleolo. L’attività di ricerca condotta ha avuto come obiettivo lo studio del ruolo della proteina tau a localizzazione nucleare nell’insorgenza della malattia di Alzheimer e nell’invecchiamento cellulare e di valutare il suo possibile utilizzo come marcatore molecolare precoce della malattia di Alzheimer. Per raggiungere tali obiettivi è stata utilizzata la linea cellulare di neuroblastoma umano SK-N-BE, le cui cellule sono assimilabili ai neuroblasti che, mediante induzione con acido retinoico, differenziano in cellule simil-neuronali. Inoltre, sono state utilizzate sezioni di tessuto cerebrale umano della regione dell’ippocampo di individui a varie età e a vari stadi della malattia di Alzheimer. L’utilizzo di tali sezioni di tessuto è stato possibile grazie alla collaborazione con l’università “Alfonso X El Sabio” di Madrid e con il dipartimento di patologia del “Hospital Universitario Fundación Alcorcón” di Madrid che hanno fornito tale materiale biologico. I risultati ottenuti hanno dimostrato che nelle cellule SK-N-BE è presente l’isoforma più piccola della proteina tau, definita 0N3R e composta di 352 residui aminoacidici. Tale isoforma è stata quindi analizzata sia nelle cellule SK-N-BE, sia nei neuroni del giro dentato e della regione CA1 dell’ippocampo. In particolare, è stata presa in considerazione la proteina tau con fosforilazioni in siti aminoacidici ritenuti importanti per la sua funzione nucleare, cioè per la possibile interazione tau-DNA, ossia nelle regioni PRD (Prolin rich domain) e MTBD (Microtubule binding domain), quali gli epitopi fosforilati AT8, AT100, T181 e S262, e l’epitopo non fosforilato Tau-1. L’epitopo AT100 (regione Thr212/Ser214 nella forma fosforilata) aumenta gradualmente nel nucleo (e in modo particolare nel nucleolo) dei neuroni dal cervello più giovane a quello senile, indicando che esso possa svolgere un ruolo di protezione della cromatina. Tale protezione diminuirebbe gradualmente con l’invecchiamento cellulare o bruscamente nel caso di una alterazione della funzionalità di tau, come nella malattia di Alzheimer. L’epitopo AT100 può quindi essere considerato un marcatore molecolare di invecchiamento neuronale e che la sua scomparsa dal nucleo può essere considerata un segnale dell’insorgenza della malattia di Alzheimer. La localizzazione di AT8 e Tau-1, corrispondenti rispettivamente alle regioni pSer202/pThr205 e Pro189/Gly207, ha dimostrato che probabilmente questa parte di tau è coinvolta nei cambiamenti conformazionali della proteina e che la presenza/assenza di fosforilazione è correlata alla funzionalità del nucleolo e al differenziamento cellulare. Tau-1 è presente nel nucleolo sia delle cellule replicative che di quelle differenziate, mentre AT8 è stato rilevato solo nelle cellule differenziate, dove occupa l'intero compartimento nucleolare. Inoltre, nelle cellule replicative in cui viene indotto il blocco della trascrizione con actinomicina-D (Act-D), AT8 compare nel nucleolo e insieme con Tau-1 si posiziona alla periferia del nucleolo, dove AT8 e Tau-1 colocalizzano con il fattore di trascrizione nucleolare UBTF. Questi risultati, ottenuti anche su linfociti indotti con PHA, indicano Tau-1 è probabilmente coinvolto nell'organizzazione e/o espressione dei geni per gli rRNA coadiuvando UBTF nel legame con l’rDNA, mentre l'epitopo AT8 di tau, la cui presenza nel nucleolo sembra essere correlata all'inattivazione trascrizionale dei geni per l’rRNA, può essere considerato un marker di differenziamento neuronale e un regolatore dell’attività del nucleolo. La localizzazione degli epitopi AT8 e Tau-1 nell’ippocampo umano di individui a varie età (da cervello fetale a cervello senile) e a vari stadi di gravità della malattia di Alzheimer (AD-I – AD-IV), ha mostrato che, nei nucleoli dei neuroni piramidali della regione CA1, AT8 tende a scomparire in età avanzata, così come risulta assente nelle cellule SK-N-BE replicative. La sua scomparsa, in un numero rilevante di neuroni di cervello senile e di Alzheimer, sembra indicare che tali cellule abbiano riacquistato, o si accingano a riacquistare, lo stato replicativo. Trattandosi di cellule differenziate terminalmente, tale processo presumibilmente non procede oltre, inducendo la morte dei neuroni con quello che potrebbe essere uno degli eventi precoci della malattia.