Prevenzione secondaria del mesotelioma pleurico maligno in popolazione esposta a fibre asbestiformi: identificazione di biomarkers molecolari e proteici

Biancavilla town (Catania, Sicily) has been recognized as a Site of National Interest (SIN) by the Ministerial Decree 468/2001 whose perimeter was approved by the Ministerial Decree 231/2002. The Decree refers to the presence of a quarry of stone material contaminated by an asbestiform fiber called fluoro-edenite (FE). An environmental exposure is therefore configured for the general population since from 1950 to 1998 the houses and streets of Biancavilla were built with materials from the aforementioned quarry. In relation to this exposure, a cluster of malignant pleural mesothelioma (MPM) was found in the Biancavilla town, which led the scientific population to perform in vivo and in vitro studies on FE. These studies have demonstrated the carcinogenicity of FE, classified by the International Agency Research on Cancer (IARC) as definitely carcinogenic to humans (Group 1). MPM is an insidious and lethal cancer, characterized by long latency and nonspecific symptoms, which cause a late diagnosis, and it is very invasive for the patient. MPM is causally related to exposure to asbestos. Cases of MPM around the world are on the rise. In Italy, a peak of incidence is estimated between 2015-2025 due to the ubiquity and exceptional persistence of the material in the environment. Currently, 25% of MPMs derive from occupational exposure, 25% from indirect exposure of the family member and 50% from exposure to fibers present in the environment. The inhalation of asbestiform fibers and their accumulation in the lung triggers a series of biomolecular organ effects including the production of reactive oxygen species (ROS), chromosomal damage, alteration of the mitotic process, growth factor signals and the apoptotic cascade, genetic mutations, deregulation of the methylation state, chronic inflammation, aberrant microRNA (miRNA) expression. There is currently no cure for MPM, and early diagnosis could improve both prognosis and monitoring of therapeutic response. The clinical and imaging signs of MPM are non‑specific; and a definitive diagnosis, which relies on histology, can sometimes be very difficult to achieve, even with the use of immunohistochemistry. To date, no single marker or panel of soluble biomarkers is available for a clear diagnosis of MPM, so the identification of specific, sensitive and minimally invasive biomarkers for MPM has been ongoing for years with encouraging but not definitive results for the prevention of MPM. In recent years, several studies have investigated a large number of miRNAs, biomarkers with a diagnostic value already recognized for different types of carcinoma, looking for a correlation with MPM, in particular these researches were aimed at demonstrating a possible correlation between the miRNA expression, cancer type and degree of cancer differentiation. MiRNAs are highly conserved non-coding RNA molecules, about 20-25 nucleotides long, which play an important regulatory role at the post-transcriptional level. By virtue of their post-transcriptional activity, they have been identified as new potentials biomarkers, related to the degree of cell differentiation, and therefore could be correlated with the type and stage of MPM. The circulating miRNAs are considered diagnostic biomarkers for various pathophysiological conditions such as cancers, neurodegenerative diseases, diabetes and other pathologies. MiRNAs possess all the characteristics of the ideal marker and provide reliable indications before the onset of clinical symptoms (early diagnosis), are sensitive to changes in the pathology (evolution of the pathology or therapeutic response), can be easily detected from fluids (blood, urine, saliva) as liquid biopsy and are easily transferable from laboratory models to humans. MiRNAs are particularly attractive biomarkers as their short nucleotide sequence remains stable, making these molecules excellent candidates for extraction and quantification starting from Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) tissue and whole blood. On these bases, the aim of the study was to identify and validate a panel of molecular biomarkers (miRNAs) and proteins in relation to the changes induced on the pleura, in subjects exposed to FE fibers in order to provide a minimally invasive screening tool for secondary prevention to MPM in a population at high risk of incidence and mortality. For these purposes, in silico analyses were first performed on healthy/exposed to asbestos fibers subjects vs. patients with MPM using the GEO2R tool available on GEO DataSets. These analyses revealed a set of miRNAs strictly involved in MPM by merging the lists of miRNAs found differentially expressed in the miRNA expression datasets contained in GEO DataSets database. The three miRNAs selected as statistically significant were hsa-miR-323a-3p, hsa-miR-101–3p, and hsa-miR-20b-5p. Secondly, functional in vitro experiments on normal pleural mesothelial cell line (MeT-5A) and MPM cell line (JU77) have been performed to test the carcinogenetic effects and epigenetic modulation induced by FE exposure. The result of the computational evaluations allowed the analysis of the expression levels of the miRNAs previously identified in silico both in vitro and in MPM vs. nonmalignant pleura FFPE tissues to evaluate differences in the expression levels of the selected miRNAs and their MPM diagnostic and prognostic potential. A customized droplet digital PCR (ddPCR) assay was used to amplify the miRNAs previously identified in silico both in vitro and in FFPE samples. Subsequently, by consulting the Catalogue of Somatic Mutation In Cancer (COSMIC) it was possible to identify the 20 most mutated genes that are known to be involved in MPM development and therefore have a dysregulated expression. Furthermore, the clinical implication of the analyzed miRNAs was assessed through the clinic-pathological data and the miRNA expression profiles analysis contained in The Cancer Genome Atlas Mesothelioma (TCGA-MESO) database and downloaded using the online exploration tool UCSC Xena Browser. Additionally, using the bioinformatics prediction tool microRNA Data Integration Portal (mirDIP) the interaction levels between the miRNAs previously identified via computational analysis and the main genes mutated and altered in MPM were evaluated. The in vitro data showed consistency between expression levels of hsa-miR-323a 3p and hsa-miR-101–3p and the in silico results (up-regulation and down-regulation respectively in MPM cases compared to controls). Instead, hsa-miR-20b-5p showed a no significant dose-dependent increase in MeT-5A cell line, but a significant up-regulation in JU77 cells vs. control and treated MeT-5A, in contrast with the in silico analysis that showed a downregulation in MPM cases compared to controls. The ex vivo data showed a different expression of the three miRNAs analyzed in MPM and healthy controls. There was a statistically significant trend of down-regulation observed for hsa-miR-323a-3p, hsa-miR-101-3p, and hsa-miR-20b-5p in MPM cases vs. controls. Furthermore, hsa-miR-101-3p showed a prognostic value for MPM because the analysis of miRNAs expression levels considering the median Overall Survival (OS), the disease-specific survival (DSS), and the progression-free interval (PFI) contained in the TCGA-MESO database revealed a significant association between hsa-miR-101-3p high expression levels and increased OS. According to the mirDIP gene target analysis these three miRNAs can target and modulate both cancer suppressor and oncogene genes playing a potentially key role in cancer cell development. With this research work, we would contribute to basic biomarkers research, and we hope to transfer these results to clinical practice for the identification of cancer cellular alterations at an early stage.

Il comune di Biancavilla (Catania, Sicilia) è stato riconosciuto Sito di Interesse Nazionale (SIN) dal DM 468/2001 il cui perimetro è stato approvato dal DM 231/2002. Il Decreto fa riferimento alla presenza di una cava di materiale lapideo contaminato da una fibra asbestiforme denominata fluoro-edenite (FE). Si configura quindi un'esposizione ambientale per la popolazione generale poiché dal 1950 al 1998 le case e le strade di Biancavilla sono state realizzate con materiali provenienti dalla predetta cava. In relazione a tale esposizione, nel comune di Biancavilla è stato riscontrato un cluster di mesotelioma pleurico maligno (MPM), che ha portato la popolazione scientifica a condurre studi in vivo e in vitro sull'FE. Questi studi hanno dimostrato la cancerogenicità del FE, classificato dall'Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro (IARC) come sicuramente cancerogeno per l'uomo (Gruppo 1). L'MPM è un tumore insidioso e letale, caratterizzato da lunga latenza e sintomi aspecifici, che causano una diagnosi tardiva, ed è molto invasivo per il paziente. L'MPM è causalmente correlato all'esposizione all'amianto. I casi di MPM nel mondo sono in aumento. In Italia si stima un picco di incidenza tra il 2015 e il 2025 dovuto all'ubiquità e all'eccezionale persistenza del materiale nell'ambiente. Attualmente, il 25% degli MPM deriva da esposizione professionale, il 25% da esposizione indiretta del familiare e il 50% da esposizione a fibre presenti nell'ambiente. L'inalazione di fibre asbestiformi e il loro accumulo nel polmone innesca una serie di effetti sugli organi biomolecolari tra cui la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), il danno cromosomico, l'alterazione del processo mitotico, i segnali dei fattori di crescita e la cascata apoptotica, le mutazioni genetiche, la deregolazione dello stato di metilazione, infiammazione cronica, espressione aberrante di microRNA (miRNA). Attualmente non esiste una cura per l'MPM e la diagnosi precoce potrebbe migliorare sia la prognosi che il monitoraggio della risposta terapeutica. I segni clinici e di imaging dell'MPM non sono specifici; e una diagnosi definitiva, che si basa sull'istologia, a volte può essere molto difficile da ottenere, anche con l'uso dell'immunoistochimica. Ad oggi, nessun singolo marcatore o pannello di biomarcatori solubili è disponibile per una chiara diagnosi di MPM, quindi l'identificazione di biomarcatori specifici, sensibili e minimamente invasivi per MPM è in corso da anni con risultati incoraggianti ma non definitivi per la prevenzione di MPM. Negli ultimi anni diversi studi hanno indagato un gran numero di miRNA, biomarcatori con valore diagnostico già riconosciuto per diversi tipi di carcinoma, cercando una correlazione con l'MPM, in particolare queste ricerche erano finalizzate a dimostrare una possibile correlazione tra l'espressione di miRNA, tipo di cancro e grado di differenziazione del cancro. I miRNA sono molecole di RNA non codificanti altamente conservate, lunghe circa 20-25 nucleotidi, che svolgono un importante ruolo regolatorio a livello post-trascrizionale. In virtù della loro attività post-trascrizionale, sono stati identificati come nuovi potenziali biomarcatori, legati al grado di differenziazione cellulare, e quindi correlati al tipo e allo stadio di MPM. I miRNA circolanti sono considerati biomarcatori diagnostici per varie condizioni fisiopatologiche come tumori, malattie neurodegenerative, diabete e altre patologie. I MiRNA possiedono tutte le caratteristiche del marker ideale e forniscono indicazioni affidabili prima dell'insorgenza dei sintomi clinici (diagnosi precoce), sono sensibili ai cambiamenti della patologia (evoluzione della patologia o risposta terapeutica), sono facilmente rilevabili dai fluidi (sangue, urina, saliva) come biopsia liquida e sono facilmente trasferibili dai modelli di laboratorio all'uomo. I miRNA sono biomarcatori particolarmente interessanti in quanto la loro breve sequenza nucleotidica rimane stabile, rendendo queste molecole eccellenti candidati per l'estrazione e la quantificazione a partire da tessuto e sangue intero fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE). Su queste basi, lo scopo dello studio è stato quello di identificare e validare un pannello di biomarcatori molecolari (miRNA) e proteine ​​in relazione ai cambiamenti indotti sulla pleura, in soggetti esposti a fibre FE al fine di fornire uno strumento di screening minimamente invasivo per prevenzione secondaria a MPM in una popolazione ad alto rischio di incidenza e mortalità. A tal fine, le analisi in silico sono state eseguite dapprima su soggetti sani/esposti con fibre di amianto rispetto a pazienti con MPM utilizzando lo strumento GEO2R disponibile su GEO DataSets. Queste analisi hanno rivelato una serie di miRNA strettamente coinvolti nell'MPM unendo gli elenchi di miRNA trovati espressi in modo differenziale nei set di dati di espressione di miRNA contenuti nel database GEO DataSets. I tre miRNA selezionati come statisticamente significativi erano hsa-miR-323a-3p, hsa-miR-101–3p e hsa-miR-20b-5p. In secondo luogo, sono stati eseguiti esperimenti funzionali in vitro sulla normale linea cellulare mesoteliale pleurica (MeT-5A) e sulla linea cellulare MPM (JU77) per testare gli effetti cancerogeni e la modulazione epigenetica indotta dall'esposizione a FE. Il risultato delle valutazioni computazionali ha consentito l'analisi dei livelli di espressione dei miRNA precedentemente identificati in silico sia in vitro che in MPM rispetto ai tessuti FFPE della pleura non maligna per valutare le differenze nei livelli di espressione dei miRNA selezionati e il loro potenziale diagnostico e prognostico MPM . Per amplificare i miRNA precedentemente identificati in silico sia in vitro che in campioni FFPE è stato utilizzato un test PCR digitale a goccia personalizzato (ddPCR). Successivamente, consultando il Catalogue of Somatic Mutation In Cancer (COSMIC) è stato possibile identificare i 20 geni più mutati noti per essere coinvolti nello sviluppo di MPM e quindi avere un'espressione disregolata. Inoltre, l'implicazione clinica dei miRNA analizzati è stata valutata attraverso i dati clinico-patologici e l'analisi dei profili di espressione dei miRNA contenuti nel database The Cancer Genome Atlas Mesotelioma (TCGA-MESO) e scaricati utilizzando lo strumento di esplorazione online UCSC Xena Browser. Inoltre, utilizzando lo strumento di previsione bioinformatica microRNA Data Integration Portal (mirDIP) sono stati valutati i livelli di interazione tra i miRNA precedentemente identificati tramite l'analisi computazionale ei principali geni mutati e alterati in MPM. I dati in vitro hanno mostrato coerenza tra i livelli di espressione di hsa-miR-323a 3p e hsa-miR-101–3p e i risultati in silico (rispettivamente up-regulation e down-regulation nei casi di MPM rispetto ai controlli). Invece, hsa-miR-20b-5p ha mostrato un aumento non significativo dose-dipendente della linea cellulare MeT-5A, ma una significativa sovraregolazione nelle cellule JU77 rispetto al controllo e al MeT-5A trattato, in contrasto con l'analisi in silico che ha mostrato una downregulation nei casi di MPM rispetto ai controlli. I dati ex vivo hanno mostrato una diversa espressione dei tre miRNA analizzati in MPM e controlli sani. È stata osservata una tendenza statisticamente significativa di down-regulation per hsa-miR-323a-3p, hsa-miR-101-3p e hsa-miR-20b-5p nei casi di MPM rispetto ai controlli. Inoltre, hsa-miR-101-3p ha mostrato un valore prognostico per MPM perché l'analisi dei livelli di espressione dei miRNA considerando la sopravvivenza globale mediana (OS), la sopravvivenza specifica della malattia (DSS) e l'intervallo libero da progressione (PFI) contenuti nel database TCGA-MESO ha rivelato un'associazione significativa tra alti livelli di espressione di hsa-miR-101-3p e aumento del sistema operativo. Secondo l'analisi del target del gene mirDIP, questi tre miRNA possono indirizzare e modulare sia i geni oncosoppressori che quelli oncogeni che svolgono un ruolo potenzialmente chiave nello sviluppo delle cellule tumorali. Con questo lavoro di ricerca, vorremmo contribuire alla ricerca di base sui biomarcatori e speriamo di trasferire questi risultati alla pratica clinica per l'identificazione delle alterazioni cellulari del cancro in una fase iniziale.