Nanoparticelle di biossido di titanio: tossicità e possibile ruolo come interferenti endocrini

In recent decades, developing countries have seen a reduction in male reproductive parameters, such as sperm quality and Leydig cell function. In 20% of infertile couples, the male factor is exclusively responsible of infertility. It is known that the increase in male infertility is due to exposure to xenobiotics with hormonal activity called Endocrine Disruptors (IE). They can affect the hormonal system of human and animals, thus compromising development, reproduction and health. Although the activity of “Classic Endocrine Disruptors” is well known, such as: pesticides, insecticides, persistent organic pollutants (POPs), perfluorinated chemicals (PFCs), polychlorinated biphenyls (PCBs), phthalates, bisphenol A (BPA) and heavy metals; it is necessary to include nanomaterials and in particular nanoparticles (NPs) among the exogenous substances present in the environment. The introduction and use of nanoscale materials is changing the our way of life, leading to a new revolution that can be called Nano Revolution. Nanoparticles find application in various sectors such as electronics, biomedicine, pharmaceuticals, cosmetics, food industry, the environmental sector; therefore their release into the environment can lead living beings, including humans, to exposure continuous and involuntary. Thanks to their extremely small size (1-100 nm), nanoparticles (NPs) are more absorbable by living organisms; consequently they can cross the circulatory system and then be distributed in various organs including the reproductive ones. Therefore, a possible endocrine activity by NPs cannot be excluded. Metal oxide nanoparticles (MONPs), are the most versatile category of nanoparticles that have multiple applications, and among these the Titanium Dioxide Nanoparticles (TiO2-NPs) are used intensively. The aim of my PhD thesis has been evaluated the possible toxic effect of titanium dioxide nanoparticles (TiO2-NPs), as endocrine disruptors on the male reproductive system through in vivo and in vitro assays; in addition their toxic effect on embryonic development was also evaluated. Commercial TiO2-NPs (P25, Degussa) were tested at concentrations of 1 mg/L, 2 mg/L and 4 mg/L on Danio rerio embryos by ZFET (Zebrafish Embryo Toxicity Test) and on male adults using a 30-day chronic toxicity test. At the end of the exposure, biomarker of oxidative stress such as Poly ADP-Ribose Polymerase-1 (PARP-1) and Heat Shock Protein-70 (Hsp70) were evaluated on zebrafish larvae, as well as the Sex Hormone Binding Globulin (SHBG) and the Protimosin-α (PTMA) were evaluated as biomarker that suggest the action of TiO2-NP as endocrine disruptors. Rates of coagulated and hatched eggs, and changes in larvae phenotype, such as larva length, were evaluated throughout the exposure period; finally, heart rate was also assessed using the DanioScope™ software. On adult male gonads, the effect of TiO2-NPs was evaluated through histomorphological changes and the expression of Sex Hormone Binding Globulin (SHBG) and P540 aromatase (P540) biomarkers by immunofluorescence assays; the expression of the SHBG, SRD5A2, SOD2 and GPX4B genes was also evaluated by qRT-PCR. Finally, the effect of TiO2-NPs was evaluated on human spermatozoa through in vitro assays. TiO2-NPs concentrations were tested at 50ppm, 100ppm, 250ppm and 500ppm, because these could be concentrations that coat a drug capsule. In fact, there is no regulation for the amount of TiO2-NPs used as an additive in drugs. Swim-up by pellets was used to incubate the spermatozoa with the TiO2-NPs solutions, for 1 hour exposure. At the end of the incubation the following sperm parameters were evaluated: motility, viability, DNA fragmentation by Halosperm and TUNNEL assay, intracellular evaluation of ROS by MiOXSYS and evaluation of biomarker Heat Shock Protein-70 (Hsp70), Sex Hormone Binding Globulin (SHBG) and Metallothionein (MT). Furthermore, the localization of TiO2-NPs on spermatozoa was evaluated by Scanning Electron Microscopy. The results obtained showed that the TiO2-NPs did not interfere with the embryonic development of Danio rerio, the embryos exposed to all TiO2-NPs concentrations (1mg/L, 2mg/L and 4mg/L) completed the development of the embryo and their hatching rate was higher than controls (p <0.05). The exposed embryos did not show marked malformations; however, there was a greater decrease in body length and an increase in heart rate (BPM) in the 4mg/L group compared to the control and other exposed groups (p <0.05). The biomarker evaluated showed that TiO2-NPs induced oxidative stress as demonstrated by the positivity to the biomarkers PARP-1 and Hsp70. Furthermore, a positivity to the SHBG biomarker was observed at the level of the larva’s head, with a higher intensity for the 4mg/L concentration; instead the biomarker PTMA showed a positivity in the whole body of the larva. In the male gonads, the TiO2-NPs caused an alteration of the morphological/structural organization of the gonad with evident detachment between the seminiferous epithelium and the basement membrane on which it physiologically rests. Disorganization of the testicular tubules was also observed for the concentration of 4 mg/L. The structural investigation using transmission electron microscopy also highlighted the presence of vacuoles and the necrosis of the Sertoli cells. The immunofluorescence investigation showed a positivity for the SHBG biomarker especially at the Leydig cell level and the same was observed for the P540 biomarker. The results of qRT-PCR showed an increase in the gene expression of the genes involved in oxidative stress and also of the gene responsible for the conversion of testosterone to dihydrotestosterone. Since Leydig cells are mainly involved in this activity, an increase in gene activity can be explained by the ability of TiO2-NPs to act as endocrine disruptors and therefore with androgenic activity. For spermatozoa, no decrease in sperm motility and viability was observed, instead fragmentation of spermatic DNA was increased due to the oxidizing activity of TiO2-NP as demonstrated by the increase in the ORP value for the concentration of 500 ppm (ORP: 206.7 mV) obtained from MiOXSYS, and the positivity for the biomarker Hsp70. A positivity in the neck of the spermatozoa was also observed for the SHBG biomarker. Overall, our investigation confirms that TiO2-NPs have the ability to induce oxidative stress both during embryonic development and at the level of the male gonad and human spermatozoa. This inevitably leads to an alteration of the ROS content with consequences on normal cellular functioning. In male gonads, the increase in ROS affects normal spermatogenesis, while in sperm cells it causes DNA damage with failure in fertilization. Furthermore, the androgen-like activity of TiO2-NPs cannot be excluded. Therefore, the results obtained can contribute to increasing knowledge on the toxicity of TiO2-NPs, whose data in the literature focus mainly on embryonic development and little on the reproductive system; furthermore, these results can be translated to man so as to increase knowledge on male infertility.

Negli ultimi decenni, i paesi in via di sviluppo hanno registrato una riduzione dei parametri riproduttivi maschili, come la qualità del seme e la funzione delle cellule di Leydig. Nel 20% delle coppie infertili il fattore maschile è la principale causa di infertilità. È noto che l’incremento dell’infertilità maschile sia dovuta all’esposizione a xenobiotici con attività ormonale chiamati interferenti endocrini (IE). Essi possono influenzare il sistema ormonale dell’uomo e degli animali, compromettendo così lo sviluppo, la riproduzione e la salute. Sebbene sia ben nota l’attività di “interferenti endocrini classici” quali: pesticidi, insetticidi, inquinanti organici persistenti (POP), sostanze chimiche perfluorurate (PFC), policlorobifenili (PCB), ftalati, bisfenolo A (BPA) e metalli pesanti; è necessario includere tra le sostanze esogene presenti nell’ambiente anche i nanomateriali e in particolare le nanoparticelle (NP). L’introduzione e l’uso di materiali su scala nanometrica, sta cambiando il nostro modo di vivere, portando ad una nuova rivoluzione che può essere definita “Nano Revolution”. Le nanoparticelle vengono applicati in vari settori come l'elettronica, la biomedicina, i prodotti farmaceutici, i cosmetici e l’industria alimentare quindi un loro rilascio a livello ambientale può determinare un’esposizione continua e involontaria per gli esseri viventi, uomo compreso. Le NP grazie alle loro dimensioni estremamente ridotte (1-100 nm) sono molto più assorbibili dagli organismi viventi; di conseguenza possono attraversare il sistema circolatorio e quindi essere distribuiti in vari organi compresi quelli riproduttivi. Non è quindi da escludere una possibile attività endocrina da parte delle NPs. Le nanoparticelle di ossido di metallo (MONPs), sono la categoria di nanoparticelle più versatili che trovano diverse applicazioni, e tra esse sono intensamente utilizzate le nanoparticelle di biossido di titanio (TiO2-NPs). Lo scopo della mia tesi è stato valutare il possibile effetto tossico delle nanoparticelle di biossido di titanio (TiO2-NPs), in qualità di interferenti endocrini sul sistema riproduttivo maschile tramite esperimenti in vivo ad in vitro; inoltre, è stato valutato anche il loro effetto tossico sullo sviluppo embrionale. TiO2-NPs commerciali (P25, Degussa) sono state testate alle concentrazioni di 1mg/L, 2mg/L e 4 mg/L sugli embrioni di Danio rerio tramite ZFET (test di tossicità acuta su embrioni di zebrafish) e sugli adulti maschi tramite un test di tossicità cronica della durata di 30 giorni. Nelle larve di zebrafish al termine dell’esposizione sono stati valutati biomarker dello stress ossidativo quali Poly ADP-Ribose Polymerase-1 (PARP-1) e Heat Shock Protein-70 (Hsp70), e i biomarker Sex hormone-binding globulin (SHBG), Prothymosin-α (PTMA) che suggeriscono l’azione delle TiO2-NPs come interferenti endocrini. Per tutto il periodo dell’esposizione sono stati valutati i tassi di uova coagulate e schiuse, e cambiamenti nel fenotipo delle larve come la lunghezza della larva; infine, è stata valutata anche la frequenza cardiaca tramite il software DanioScope. Negli adulti maschi, è stato esaminato l’effetto delle TiO2-NPs sulle gonade quindi sono state valutate tutte le alterazioni isto-morfologiche della gonade e tramite indagini d’immunofluorescenza sono stati valutati i biomarker Sex hormone-binding globulin (SHBG) e P540 Aromatase (P540), inoltre tramite qRT-PCR è stata valutata l’espressione dei geni SHBG, SRD5A2, SOD2 and GPX4B. Infine, l’effetto delle TiO2-NPs è stato valutato sulle cellule spermatiche umane tramite esperimenti in vitro. Sono state testate le concentrazioni di TiO2-NPs pari a 50 ppm, 100ppm, 250 ppm e 500 ppm che corrispondono a quelle che potrebbero rivestire una capsula di farmaco, dato che non esiste una regolamentazione per la quantità di TiO2-NPs usata come additivo nei farmaci. È stato utilizzato uno swim-up da pellet per incubare le cellule spermatiche con le soluzioni di TiO2-NPs, per un tempo totale di 1 ora. Al termine dell’incubazioni sono stati valutati i seguenti parametri spermatici: motilità, vitalità, frammentazione del DNA tramite Halosperm e saggio TUNNEL, valutazione intracellulare dei ROS tramite MiOXSYS e valutazione dei biomarker Heat Shock Protein-70 (Hsp70), Sex hormone-binding globulin (SHBG) e Metallothionein (MT). Infine, la localizzazione delle TiO2-NPs sulle cellule spermatiche è stata valutata tramite microscopia elettronica a scansione. I risultati ottenuti hanno dimostrato che le TiO2-NPs non alterano lo sviluppo embrionale di Danio rerio, gli embrioni esposti a tutte le concentrazioni di TiO2-NPs (1mg/L, 2mg/L and 4 mg/L) completavano lo sviluppo embrione, e il loro tasso di schiusa era maggiore rispetto ai controllo ( p< 0,05). Gli embrioni esposti non mostravano malformazioni spiccate; tuttavia, è stata evidenziata una diminuzione nella lunghezza del corpo e un aumento delle frequenza cardiaca (BPM) maggiore nel gruppo 4mg/L rispetto al controllo e agli altri gruppi esposti (p< 0,05). I biomarker valutati hanno dimostrato che le TiO2-NPs inducevano stress ossidativo come dimostrato dalla positività ai biomarker PARP-1, Hsp70. Inoltre, una positività al biomarker SHBG è stata osservata a livello della testa della larva, con un’intensità maggiore per la concentrazione 4mg/L; invece, il biomarker PTMA evidenziava una positività in tutto il corpo della larva. Nelle gonadi degli adulti, le TiO2-NPs hanno causato un’alterazione nell’organizzazione morfologica/strutturale della gonade con evidente distacco tra l’epitelio seminifero e la membrana basale su cui fisiologicamente poggia. Per la concentrazione 4mg/L è stato anche osservata una disorganizzazione dei tubuli testicolare. L’indagine strutturale tramite microscopia elettronica a trasmissione ha inoltre evidenziato la presenza di vacuoli e la necrosi delle cellule del Sertoli. L’indagine d’immunofluorescenza ha mostrato una positività per il biomarker SHBG soprattutto a livello delle cellule del Leydig e lo stesso è stato osservato per il biomarker P540. I risultati delle qRT-PCR hanno mostrato un aumento dell’espressione genica dei geni coinvolti nello stress ossidativo e anche del gene responsabile della conversione del testosterone in diidrotestosterone. Poichè le celle del Leydig sono principalmente coinvolte in questa attività, un aumento dell’attività genica si può spiegare con la capacità delle TiO2-NPs di agire come interferenti endocrini e quindi con attività androgenica. A livello delle cellule spermatiche, non è stato osservata una diminuzione delle motilità e vitalità spermatica, invece è incrementata la frammentazione del DNA spermatico dovuta all’attività ossidante delle TiO2-NPs come dimostrato dall’aumento del valore di ORP, per la concentrazione di 500ppm (ORP: 206,7 mV), ottenuto tramite MiOXSYS e dalla positività osservata per le Hsp70. Una positività a livello del collo dello spermatozoo è stata osservata anche per il biomarker SHBG. Complessivamente, la nostra indagine conferma che TiO2-NPs hanno la capacità di indurre stress ossidativo sia durante lo sviluppo embrionale, sia a livello della gonade maschile e delle cellule spermatiche umane. Ciò comporta inevitabilmente un’alterazione del contenuto di ROS con conseguenze sul normale funzionamento cellulare. Nelle gonade maschile, l’aumento di ROS ha effetti sulla normale spermatogenesi, invece nelle cellule spermatiche è causa di danno al DNA con insuccesso nella fecondazione. Inoltre, non è da escludere l’attività simil-androgenica delle TiO2-NPs. Dunque, i risultati ottenuti possono contribuire ad aumentare le conoscenze sulla tossicità delle TiO2-NPs, i cui dati presenti in letteratura si concentrano principalmente sullo sviluppo embrionale e poco sul sistema riproduttivo; inoltre, tali risultati possono essere traslasti sull’uomo così da incrementare le conoscenze sull’infertilità maschile.