La riattivazione del ciclo cellulare e il ruolo della proteina tau nucleolare nell’avvio della neurodegenerazione

In the last decades aging disorders drew the interest of the scientific community, due to the gradual increase of average age of the World’s population. Pathologies such as Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and other tauopathies are linked to qualitative and quantitative variations of tau protein’s isoforms with nuclear and nucleolar localization. This thesis describes the research on neuroblastoma cell line SH-SY5Y, that after retinoic acid stimulation differentiate in adult neuronal-like cells and can degenerate by specific compounds induction in a cell cycle restarting-dependent way. The “cell cycle hypothesis” proposes that neurodegeneration in AD and similar pathologies occurs cause to metabolic dysfunctions that bring the resting neurons to re-enter in G1 and start an abortive proliferation that ends with cell death. Tau isoforms (Tau-1, AT8) with different phosphorylation state and specific localization in replicative, differentiated, or degenerative conditions were used to investigate this mechanism. Variations of cell cycle were analyzed by evaluation of cyclins expression (CCND1, CCNE1, CCNA2, CCNB1), setting up an in vitro neurodegeneration system with replicative SH-SY5Y comparable to neuroblasts, and differentiated SH-SY5Y like adult neurons, also treated with specific compounds to induce cell cycle reactivation. The disruption of cellular homeostasis is possibly through stimulation by staurosporine as apoptosis trigger, forskolin already known as PKA activator and tau hyperphosphorylation inductor in AT8 site (S202/T205) and aniline, known for its oxidative properties. The recognition of molecules that trigger neurodegeneration and the understanding of strategies to prevent the cell death activation are indeed important goals. To evaluate the possibility to stop neurodegeneration after a sudden and unexpected cell cycle reactivation was used PACAP peptide (pituitary adenylate cyclase-activating peptide), already known for its neurotrophic and neuroprotective properties. It showed a double effect depending on the inductor compound used, revealing the forskolin and aniline potential. The development of an in vitro system able to stop neurons degeneration and the possibility of natural and human-derived molecules to induce this stop would be an important turning point in the treatment of age-related pathologies that have a significant impact on human population and national health service.

Negli ultimi decenni si è verificato un incremento dell’interesse della comunità scientifica riguardo alle alterazioni cellulari legate all’invecchiamento, a causa del progressivo aumento dell’età media della popolazione mondiale. Tali patologie, tra cui la malattia di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica e le altre taupatie sono correlate a variazioni qualitative e quantitative delle isoforme della proteina tau a localizzazione nucleare e nucleolare. La presente tesi di dottorato descrive le ricerche effettuate con la linea cellulare di neuroblastoma umano SH-SY5Y, le cui cellule sottoposte a stimolazione con acido retinoico differenziano in cellule simil-neuronali adulte e che per effetto di specifiche sostanze possono andare incontro a neurodegenerazione con un meccanismo che include il tentativo di riavvio del ciclo cellulare. Infatti, l’“ipotesi del ciclo cellulare” afferma che il processo neurodegenerativo, che si attiva nella malattia di Alzheimer e in altre patologie neurodegenerative, si verifica a causa di disfunzioni metaboliche che determinano il rientro in fase G1 in cellule ormai adulte, le quali escono dalla fase di quiescenza e iniziano un processo di proliferazione, che risulterà essere abortiva, cioè non viene completato e quindi culmina con la morte della cellula stessa. Per analizzare tale andamento sono state studiate isoforme della proteina tau (Tau-1, AT8) con diverso stato di fosforilazione, la cui localizzazione intracellulare sembra essere specifica nelle diverse condizioni cellulari: proliferative, differenziate, indotte verso la degenerazione. L’analisi delle variazioni del ciclo cellulare è stata effettuata osservando l’espressione delle cicline (CCND1, CCNE1, CCNA2, CCNB1) fondamentali per il passaggio tra le diverse fasi del ciclo. Si è messo a punto un sistema di neurodegenerazione in vitro, utilizzando le cellule SH-SY5Y replicative paragonabili ai neuroblasti immaturi, differenziate in modo da mimare i neuroni adulti e trattate con specifiche sostanze per innescare il riavvio del ciclo. L’utilizzo della staurosporina nota per essere un attivatore dell’apoptosi, della forskolina quale induttore della PKA e dell’iperfosforilazione di tau nel sito AT8 (S202/T205), oppure dell’anilina, induttore dello stress ossidativo, ha permesso di analizzare la progressione del ciclo dopo aver turbato l’omeostasi cellulare. Un traguardo fondamentale consiste, infatti, nel riconoscimento non solo delle molecole che innescano la degenerazione neuronale, ma anche nella comprensione dei meccanismi che permettono di contrastarla prima che il processo di morte cellulare venga attivato. Per valutare la possibilità di bloccare il processo neurodegenerativo indotto dall’avvio improvviso e imprevisto del ciclo cellulare in cellule differenziate è stato utilizzato il peptide PACAP (pituitary adenylate cyclase-activating peptide), noto in letteratura per le sue funzioni neurotrofiche e neuroprotettive. In tal modo si è cercato di capire se l’azione di tale molecola sia in grado di bloccare l’attivazione aberrante del ciclo prima dell’innesco del processo di morte cellulare. I risultati ottenuti con il PACAP hanno mostrato un duplice effetto, in base alla molecola induttrice utilizzata (forskolina o anilina), indicando le diverse potenzialità di tale molecola. La messa a punto di un sistema in vitro che consente di bloccare la degenerazione neuronale e il fatto che tale blocco possa essere indotto da molecole naturali prodotte dal nostro stesso organismo sarebbe sicuramente una svolta importante nella cura di quelle patologie correlate all’invecchiamento che hanno un grande impatto sulla popolazione umana e sul servizio sanitario nazionale.