Alterazioni immunologiche su cellule mesenchimali stromali e linee cellulari di Leucemia Mieloide Cronica (LMC)

INTRODUCTION Chronic myeloid leukemia is a myeloproliferative disorders characterized by the presence of Philadelphia chromosome that derived from a reciprocal translocation between chromosome 9 and 22 t(9;22). Increasing evidence suggests that only a rare subset of immature cells within the tumor microenvironment, the leukemic stem cells (LSC), are responsible for propagating CML and for relapse when tyrosine kinase inhibitor (TKI) treatment is withdrawn. LSC survival and chemo-resistance strictly depend on the bone marrow (BM) niche and, therefore, this site could represent an important target for new pharmacological agents. In particular, MSC are a key component of BM microenvironment playing a close interplay with LSC cellsMSC can polarize into two different types with distinct phenotypes defined MSC1 and MSC2 through the stimulation of specific Toll-like receptors (TLR). In particular, TLR4 stimulation polarizes MSC toward a pro-inflammatory MSC1 phenotype, while stimulation of TLR3 results in the polarization toward an immunosuppressive MSC2 phenotype. In acute myeloid leukemia and lung cancer TLR4+ MSC more powerfully inhibited NK cell function obstructing anti-tumor immunity functions. It has been demonstrated that TKI, in particular Imatinib and Dasatinib, have differential effects on CML-LSCs through the regulation of mitochondria oxidative phosphorylation (OXPHOS) which may provide a new target for eliminating CML-LSCs in the context of TKI discontinuation. The IGF family includes a complex of proteins involved in proliferation, differentiation and apoptosis and carcinogenesis. Several studies show that IGFBP-6 can both inhibit and stimulate growth in different tumor types, making it an interesting target to study. Like IGFBP-6, SHH dysregulations are also involved in the development and progression of different types of cancer. AIM The purpose of the study was to investigate the interactions between stromal and tumor cells in vitro, the effects of Dasatinib treatments on co-culture cells, IGFBP-6 and SHH involvement on CML and TLR4 involvement on IGFBP-6 / SHH system. RESULTS Data obtained show that co-culture determines an increase in IGFBP -6 levels on both HS-5 and LAMA-84 cell lines. On one hand, LAMA-84 become resistant to Dasatinib after IGFBP-6 treatment, and on the other hand HS-5 cells acquire a CAF phenotype characterized by αSMA FAP1 and TGFß upregulation. HS-5 and LAMA-84 co-colture determines TLR4 upregulation and IGFBP-6, SHH and Dasatinib treatment modulate TLR4 expression. CONCLUSION The pathways of IGFBP-6 and SHH can be considered as possible targets of new chemotherapy drugs capable of overcoming resistance to current therapies although the mechanisms underlying this resistance are unclear and require further investigation.

INTRODUZIONE La Leucemia Mieloide Cronica è una malattia mieloproliferativa caratterizzata dalla presenza del cromosoma Philadelphia che deriva da una traslocazione reciproca tra il cromosoma 9 e 22 t(9;22). Diversi studi hanno dimostrato che solo un raro sottoinsieme di cellule immature all'interno del microambiente tumorale, le cellule staminali leucemiche (LSC), sono responsabili della propagazione della LMC e della ricaduta dopo sospensiome del trattamento con inibitori della tirosin-chinasi (TKI). La sopravvivenza e la chemioresistenza delle LSC dipendono strettamente dalla nicchia del midollo osseo (BM) e, pertanto, quest’ultimo rappresenta un importante bersaglio per nuovi agenti farmacologici. In particolare, le MSC sono una componente chiave del microambiente midollare e sono caratterizzate da una stretta interazione con le cellule LSC. Le MSC possono polarizzarsi in due fenotipi distinti, definiti MSC1 e MSC2 attraverso la stimolazione di specifici recettori Toll-like (TLR). In particolare, la stimolazione di TLR4 polarizza le MSC verso un fenotipo MSC1 pro-infiammatorio, mentre la stimolazione di TLR3 determina la polarizzazione verso un fenotipo MSC2 immunosoppressivo. Nella leucemia mieloide acuta e nel cancro del polmone, le MSC che esprimono il TLR4, inibiscono maggiormente la funzione delle cellule NK ostacolando le funzioni dell'immunità antitumorale. È stato dimostrato che i TKI, in particolare Imatinib e Dasatinib, hanno effetti differenziali sulle CML-LSC attraverso la regolazione della fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS) che può rappresentare un nuovo target per l'eliminazione delle CML-LSC durante la sospensione del trattamento farmacologico. La famiglia IGF comprende un complesso di proteine coinvolte nella proliferazione, differenziazione, apoptosi e carcinogenesi. Diversi studi dimostrano che l'IGFBP-6 può sia inibire che stimolare la crescita in diversi tipi di tumore, rendendolo un target interessante da studiare. Come l'IGFBP-6, anche le disregolazioni SHH sono coinvolte nello sviluppo e nella progressione di diversi tipi di cancro. OBIETTIVI Lo scopo dello studio è stato indagare le interazioni tra cellule stromali e tumorali in vitro, gli effetti dei trattamenti con Dasatinib sulle cellule in co-coltura, il coinvolgimento di IGFBP-6 e SHH sulla LMC e il coinvolgimento di TLR4 sul sistema IGFBP-6/SHH. RISULTATI I dati ottenuti mostrano che la co-coltura determina un aumento dei livelli di IGFBP -6 su entrambe le linee cellulari HS-5 e LAMA-84. Da un lato, le LAMA-84 diventano resistenti al Dasatinib dopo il trattamento con IGFBP-6, dall'altro le cellule HS-5 acquisiscono un fenotipo CAF caratterizzato da un aumento dei livelli di espressione di αSMA, FAP1 e TGFß. La co-coltura tra le HS-5 e le LAMA-84 determina un aumento dei livelli di espressione di TLR4; mentre il trattamento con IGFBP-6, SHH e Dasatinib ne modula la sua espressione. CONCLUSIONE I pathway IGFBP-6 e SHH possono essere considerati come possibili target di nuovi farmaci chemioterapici in grado di superare la resistenza alle attuali terapie, sebbene i meccanismi più comuni con i quali tale resistenza si realizza non siano del tutto chiari e per tale ragione richiedono ulteriori indagini.