Attività antitumorale potenziata dalla combinazione di Dasatinib e Selinexor nella Leucemia Mieloide Cronica

Introduction. Chronic Myeloid Leukemia (CML) is a neoplasm characterized by the uncontrolled increase in the number of leukemic progenitors in bone marrow and in peripheral blood. The discovery of the pivotal role of BCR-ABL has allowed the development of tyrosine kinase inhibitor (TKI) drugs that have changed the history of this disease making it substantially controllable. Despite the impressive therapeutic successes, TKI-resistance, the persistence of Leukemia Stem Cells (LSC), and the high rate of relapse upon discontinuation of treatment call for the identification of new therapeutic strategies. Recent evidences demonstrated a crucial role of mitochondrial activity and Heme Oxygenase 1 (HO1) in the development of TKI-resistance. Selinexor (SLX) is an inhibitor of Exportin 1 recently approved for the treatment of refractory multiple myeloma. Its antitumor action seems to be linked to mitochondrial impairment and to the nuclear accumulation of tumor suppressors, but no data are currently available on CML. Aim of this study is to evaluate the efficacy of SLX treatment alone and in combination with Dasatinib (DAS) on CML cell lines and the effects of treatment on mitochondrial activity and HO1 expression. Material and methods. SLX and DAS were tested on human CML cell lines K562 and LAMA84. In order to evaluate mitochondrial mass and apoptotic population, flow cytometry was performed. Gene expression was investigated with Real Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction. Western blot analysis and immunofluorescence were used in order to evaluate HO1 expression and its nuclear translocation. Unpaired T test or ANOVA, where appropriate, were used to analyze the data and a p value <0.05 was considered statistically significant. Results. Data from flow cytometry show that 50nM and 100 nM SLX treatment did not affect LAMA 84 cell viability after 48 hours. On the contrary, a significative reduction in cell viability was observed using 1μM, 2μM and 5μM SLX (45±32%, 55±39% and 60±43% compared to untreated cells, respectively; p<0.0001). The dose dependent reduction on cell viability was also observed after 72h of treatment. No significant variation in cell viability were observed after 48h of treatment in K562 cell line. A significant increase in cell apoptosis was observed in K562 cells after 72h of treatment with 1μM, 2μM and 5μM SLX (17±12,5%, 36±26% and 68±48,2% compared to control, respectively; p <0.0001). A significant percentage of mitochondrial depolarized cells after 48h of 50nM and 100nM SLX was observed in LAMA 84 cell line (3±1,8% and 5±3,6%, respectively; p<0.0001). Mitochondrial depolarization increased massively with 1μM, 2μM and 5μM SLX compared to control of about 64±45%, 68±47% and 71±49%, respectively (p<0.0001). In K562 cell line, according to previous results, no increase in mitochondrial depolarization was observed after 48h treatment and the increase was evident after 72h of treatment in the groups 1μM, 2μM and 5μM SLX in a dose dependent manner (37%, 45%, and 70% respectively; p<0.0001). In order to investigate the efficacy of the combination treatment DAS/SLX, K562 and LAMA84 cell lines were treated with DAS 2nM alone or in combination with SLX 500nM and 1μM for 24h, 48h and 72h. In K562 cell line DAS alone was sufficient to significantly reduce cell viability after 48h and 72h (28±20,3% and 62±44,1% compared to untreated cells, respectively; p<0.001) and combination with SLX did not improve significatively the TKI-induced apoptosis, therefore the subsequent experiments took into account LAMA84 cell lines. DAS and SLX alone decreased cell viability of LAMA84 cells of 5±3,4% and 10±6,2%, respectively, compared to untreated cells. Their combination significantly increased apoptosis of 24±17,3% in DAS/500nM SLX group and 33±23,2% in DAS/1μM SLX group, compared to untreated cells (p<0.0001). DAS treatment caused a significant mitochondrial depolarization with a reduction of diethyloxacarbocyanine iodide mean fluorescence intensity (MFI) of 20±13,6% after 24h compared to untreated cells (p<0.0001). DAS/SLX treatment significantly increased the percentage of DAS-induced depolarized cells of 78±44,9%, compared to DAS alone treated cells (p<0.0001). Since a strong depolarization of mitochondria could be accompanied by a drastic reduction of mitochondrial mass, mitochondria of CML cells were evaluated by using MitoTracker staining and flow cytometry in DAS alone, SLX alone and DAS/SLX groups. DAS/SLX increased the reduction of MitoTracker-MFI of 16±9.2% compared to DAS alone (p<0.0001). As expected from these data, an increased expression of PTEN-induced kinase 1 protein was observed compared to untreated cells (p<0.05). To respond to mitochondrial stress, CML cells treated with DAS alone promoted compensatory upregulation of mitochondrial dynamic-related genes Mitofusin (MFN) 1, MFN2, Optic Atrophy 1 (OPA) (p<0.0001, p<0.001 and p<0.0001 compared to untreated cells, respectively), as well as the oxidative phosphorylation related gene as Cytochrome B (CytB) and ATP synthase (ATPsynt) (p<0.0001 and p<0.01 compared to untreated cells, respectively). On the contrary, DAS-induced expression of MFN1, MFN2, OPA, CytB and APTsynt expression was significantly downregulated in cells treated with DAS/SLX (p<0.0001, p<0.01, p<0.0001, p<0.0001, p<0.0001, p<0.001, compared to DAS alone group, respectively), highlighting a close link between SLX treatment and mitochondrial impairment. Moreover, SLX alone significantly reduced all the aforementioned genes (p<0.0001, p<0.01, p<0.0001, p<0.0001 and p<0.001, compared to untreated cells). Finally, levels of HO1 were evaluated in DAS, SLX and DAS/SLX groups. Western blot analysis showed that DAS treatment significantly increased HO1 levels compared to untreated cells (p<0.0001); on the contrary, both SLX alone and DAS/SLX decreased HO1 expression compared to DAS treated cells (p<0.0001). Immunofluorescence showed that DAS treatment significantly induced HO1 nuclear translocation, which, conversely, resulted decreased in DAS/SLX group. Conclusion. SLX affected the viability of CML cells. DAS/SLX treatment increased the DAS-induced apoptosis in LAMA84 cell causing a strong mitochondrial depolarization associated to a significant decrease of mitochondrial mass. In the DAS-group, a compensatory upregulation of mitochondrial dynamic-related genes was observed. This overexpression was downregulated in the DAS/SLX group. DAS treatment significantly increased HO1 expression and its nuclear translocation, both resulted decreased in DAS/SLX group. DAS/SLX combination seems to be effective in CML cells disrupting mitochondrial dynamics and mitochondrial fitness, which are potential active mechanisms of LSCs resistance. Further studies are needed to clarify whether combination therapy with TKI and SLX may be useful in the treatment of refractory forms of CML or in eradicating LSCs.

Introduzione. La Leucemia Mieloide Cronica (CML) è una neoplasia caratterizzata da un incontrollato aumento del numero di progenitori leucemici nel midollo osseo e nel sangue periferico. La scoperta del ruolo centrale di BCR-ABL ha permesso lo sviluppo dei farmaci inibitori delle tirosin chinasi (TKI) che hanno cambiato la storia di questa malattia rendendola sostanzialmente controllabile. Nonostante il clamoroso successo terapeutico, la resistenza al trattamento, la persistenza di cellule staminali leucemiche e l’alto tasso di recidiva dopo interruzione del trattamento stimolano l’identificazione di nuove strategie terapeutiche. Recenti evidenze hanno dimostrato un ruolo cruciale dell’attività mitocondriale e di Eme Ossigenasi 1 (HO1) nello sviluppo di resistenza a TKI. Selinexor (SLX) è un inibitore di Esportina 1 recentemente approvato per il trattamento del mieloma multiplo refrattario. La sua azione antitumorale sembra essere legata ad un danno mitocondriale e all’accumulo nucleare di soppressori tumorali, ma non ci sono dati attualmente disponibili su CML. Scopo di questo studio è valutare l’efficacia di SLX in monotrattamento e in combinazione con Dasatinib (DAS) su linee cellulari di CML e gli effetti del trattamento su attività mitocondriale ed espressione di HO1. Materiali e metodi. SLX e DAS sono stati testati su linee cellulari umane di CML K562 e LAMA84. È stata eseguita citometria a flusso per valutare la massa mitocondriale e la popolazione apoptotica. L’espressione genica è stata investigata con reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa in tempo reale. Analisi western blot e immunofluorescenza sono stati usati per valutare espressione di HO1 e la sua traslocazione nucleare. Test T di Student per dati non appaiati o ANOVA, dove appropriato, sono stati usate per analizzare i dati e un valore p <0.05 è stato considerato statisticamente significativo. Risultati. I dati della citometria a flusso mostrano che 50nM and 100 nM di SLX non influenzavano la vitalità delle cellule LAMA84 dopo 48 ore. Al contrario, una significativa riduzione della vitalità cellulare è stata osservata usando 1μM, 2μM e 5μM di SLX (45±32%, 55±39% and 60±43% comparata con cellule non trattate, rispettivamente; p<0.0001). La riduzione dose dipendente della vitalità cellulare è stata anche osservata dopo 72 ore di trattamento. Nessuna significativa variazione nella vitalità cellulare è stata osservata dopo 48 ore di trattamento sulla linea cellulare K562. Un significativo aumento dell’apoptosi cellulare è stato osservato nella linea cellulare K562 dopo 72 ore di trattamento con 1μM, 2μM e 5μM di SLX (17±12,5%, 36±26% and 68±48,2% comparata con controllo, rispettivamente; p <0.0001). Una significativa percentuale di mitocondri di cellule con depolarizzazione mitocondriale è stata osservata dopo 48 ore di trattamento con 50nM e 100nM di SLX nella linea cellulare LAMA84 (3±1,8% e 5±3,6%, rispettivamente; p<0.0001). La depolarizzazione mitocondriale aumentava massivamente con 1μM, 2μM e 5μM di SLX comparata al controllo of 64±45%, 68±47% and 71±49%, rispettivamente (p<0.0001). Nella linea cellulare K562, in accordo con i precedenti risultati, Nessun aumento della depolarizzazione mitocondriale è stato osservato dopo 48 ore di trattamento e l’aumento era evidente dopo 72 ore di trattamento nei gruppi 1μM, 2μM e 5μM di SLX in maniera dose dipendente (37%, 45%, e 70% rispettivamente; p<0.0001). Con lo scopo di studiare l’efficacia del trattamento di combinazione DAS/SLX, le linee cellulari K562 e LAMA84 sono state trattate con DAS 2nM in monoterapia o in combinazione con SLX 500nM e 1μM per 24, 48 e 72 ore. Nella linea cellulare K562, DAS in monoterapia era sufficiente per ridurre significativamente la vitalità cellulare dopo 48 e 72 ore (28±20,3% e 62±44,1% comparata con cellule non trattate, rispettivamente; p<0.001) e la combinazione con SLX non aumentava significativamente l’apoptosi indotta da TKI, dunque gli esperimenti successivi hanno considerato solo la linea cellulare LAMA84. DAS e SLX in monotrattamento riducevano la vitalità cellulare della linea cellulare LAMA84 di 5±3,4% e 10±6,2%, rispettivamente, comparata con le cellule non trattate. La loro combinazione aumentava significativamente l’apoptosi di 24±17,3% nel gruppo DAS/500nM SLX e 33±23,2% nel gruppo DAS/1μM SLX, comparata con cellule non trattate (p<0.0001). Il trattamento con DAS causava una significativa depolarizzazione mitocondriale con una riduzione dell’intensità media di fluorescenza (MFI) di dietilossacarbocianina ioduro di 20±13,6% dopo 24 ore comparata con cellule non trattate (p<0.0001). Il trattamento DAS/SLX aumentava significativamente la percentuale di cellule con depolarizzazione DAS-indotta di 78±44,9%, rispetto alle cellule trattate con DAS in monotrattamento (p<0.0001). Dal momento che una forte depolarizzazione mitocondriale potrebbe essere accompagnata da una drastica riduzione della massa mitocondriale, i mitocondri delle cellule con CML sono stati valutati usando la colorazione MitoTracker e la citometria a flusso nei gruppi DAS in monotrattamento, SLX in monotrattamento e DAS/SLX. DAS/SLX aumentava la riduzione di MitoTracker-MFI di 16±9.2% rispetto a DAS in monotrattamento (p<0.0001). Come atteso da questi dati, un aumento dell’espressione di protein chinasi PTEN-indotta 1 è stato osservato rispetto alle cellule non trattate (p<0.05). Per rispondere allo stress mitocondriale, le cellule di CML trattate con DAS in monotrattamento promuovevano una sovraregolazione compensatoria dei geni correlate alla dinamica mitocondriale Mitofusina (MFN) 1, MFN2, Atrofia Ottica (OPA) 1 (p<0.0001, p<0.001 e p<0.0001 comparata con cellule non trattate, rispettivamente), come anche i geni correlati alla fosforilazione ossidativa come Citocromo B (CytB) and ATP sintetasi (ATPsynt) (p<0.0001 e p<0.01 comparata alle cellule non trattate, rispettivamente). Al contrario, l’espressione DAS-indotta di MFN1, MFN2, OPA, CytB and ATPsynt era significativamente sottoregolata nelle cellule trattate con DAS/SLX (p<0.0001, p<0.01, p<0.0001, p<0.0001, p<0.0001, p<0.001, comparate col gruppo DAS in monotrattamento, rispettivamente), evidenziando uno stretto legame tra il trattamento con SLE e il danno mitocondriale. Inoltre, SLX in monotrattamento riduceva significativamente tutti i geni prima menzionati (p<0.0001, p<0.01, p<0.0001, p<0.0001 e p<0.001, rispetto alle cellule non trattate). Infine, sono stati valutati i livelli di HO1 nei gruppi DAS, SLX e DAS/SLX. L’analisi Western blot ha mostrato che il trattamento con DAS aumentava significativamente i livelli di HO1 comparato con le cellule non trattate (p<0.0001); al contrario, entrambi SLX in monotrattamento e DAS/SLX diminuivano l’espressione di HO1 rispetto alle cellule trattate con DAS (p<0.0001). L’immunofluorescenza ha mostrato che il trattamento con DAS aumentava significativamente la traslocazione nucleare di HO1 che, al contrario, risultava ridotta nel gruppo DAS/SLX. Conclusioni. SLX ha avuto un impatto sulla vitalità delle cellule con CML. Il trattamento con DAS/SLX aumentava l’apoptosi DAS-indotta nelle cellule LAMA84 causando una forte depolarizzazione mitocondriale associata ad una significativa riduzione della massa mitocondriale. Nel gruppo DAS in monoterapia è stata osservata una sovraregolazione compensatoria dei geni correlati alla dinamica mitocondriale. Questa era invece sottoregolata nel gruppo DAS/SLX. Il trattamento con DAS aumentava significativamente l’espressione di HO1 e la sua traslocazione nucleare, entrambi risultavano ridotte nel gruppo DAS/SLX. La combinazione DAS/SLX sembra essere efficace nell’interrompere la dinamica e il fitness mitocondriale che sono un potenziale meccanismo di resistenza delle cellule staminali leucemiche. Futuri studi sono necessari per chiarire se la terapia di combinazione con TKI e SLX può essere utile nel trattamento delle forme refrattarie di CML o nell’eradicazione delle cellule staminali leucemiche.