Indagine sul determinismo genetico per la tolleranza agli stress biotici in limone combinando approcci genetici e istologici

Lemon [Citrus limon (L.) Burm. f.] is an evergreen three crop belonging to the genus Citrus, family Rutaceae, and it is appreciated worldwide for the organoleptic and nutraceutical properties of both the juice and the peel of its fruits. Around the 48% of global lemon production takes place in the countries of the Mediterranean and Black Sea areas (Spain, Ita-ly, Greece, Turkey, Egypt, Lebanon) even if in this basin its cultivation is strongly hampered by the endemic presence of the mitosporic fungus Plenodomus tracheiphilus (Petri) Gruyter, Aveskamp and Verkley (syn. Phoma tracheiphila (Petri) Kantschaveli and Gikashvili) which causes a severe tracheomycosis called mal secco. The pathogen penetrates plants through wounds and colonises xylem vessels causing vein chlorosis of young shoots leaves, followed by leaf fall, wood discoloration, necrosis, and the progressive desiccation of the whole plant. To date, no agronomic or chemical means have proven to be effective in containing the diffusion of the pathogen, neither breeding programs reached the goals of deciphering the genetic mechanisms of resistance to the pathogen and of developing novel varieties coupling optimal fruit quality and tolerance to mal secco disease. A lemon segregating population (125 individuals) was developed by crossing the mal secco-tolerant lemon variety ‘Interdonato’ (female parent) with ‘Femminello Siracusano 2Kr’ lemon (male parent), which produces good quality fruits but is highly susceptible to mal secco and was employed for a marker-trait association study aimed at the identification of molecular markers linked to the resistance towards mal secco. The behaviour of the full-sib population towards mal secco infection has been monitored after artificial inoculation of the pathogen, through an approach including visual assessment of the symptoms. The presence of the pathogen in symptomatic tissues was then assessed by Real Time PCR amplification and in vitro isolation. In citrus reference genotypes, histological studies were also performed for investigating more in depth resistance towards mal secco and revealed a correlation between xylem vessel density and susceptibility to the disease. Taking advantage from the recent de novo sequencing of lemon genome, the full-sib population was genotyped through the Single Primer Enrichment Technology (SPET) approach, and QTL analysis on selected SNPs led to the identification of genomic regions significantly associated with resistance to mal secco disease, where genes were in silico annotated and gene ontology analysis highlights their involvement in defence response to fungus attack and to wounding. Since the lemon segregating population was naturally attacked by the two-spotted spider mite (Tetranychus urticae Koch), a damaging phytophagous mite difficult to control, showing a wide range of symptoms among the different genotypes, the response of the plants to the phytophagous mite was also considered. To do so, bioassays were developed ad hoc using detached leaves placed in special experimental arenas and the QTL analysis was also performed. Among in silico annotated genes, two encoding for eugenol synthase, a well-known acaricide volatile compound, were identified. This proves that even though the full-sib population was constituted for a specific purpose, it could be also useful for studying many other agronomic traits of interest (e.g., resistance towards pathogens and pests, fruit quality, spinescence, polyembryony, etc.). Overall, phenotyping protocols were employed for large-scale susceptibility assessment for mal secco disease and for the two-spotted spider mite attack, and candidate genes associated with resistance to both biotic stresses were successfully identified. In the next future, the results of the present research will be implemented in Marker Assisted Selection (MAS) and in genome editing experiments, thus improving the cost- and time-effectiveness of lemon genetic improvement programs.

Il limone [Citrus limon (L.) Burm. f.] è una pianta arborea sempreverde appartenente al genere Citrus, famiglia delle Rutaceae, ed è apprezzata in tutto il mondo per le proprietà organolettiche e nutraceutiche del succo e della buccia dei suoi frutti. Circa il 48% della produzione mondiale di limoni avviene nei paesi dell'area del Mediterraneo e del Mar Nero (Spagna, Italia, Grecia, Turchia, Egitto, Libano) anche se in questo areale la sua coltivazione è fortemente ostacolata dalla presenza endemica del fungo mitosporico Plenodomus tracheiphilus (Petri) Gruyter, Aveskamp e Verkley [sin. Phoma tracheiphila (Petri) Kantschaveli e Gikashvili] che causa la grave tracheomicosi meglio nota come mal secco. Il patogeno pene-tra nelle piante attraverso le ferite e colonizza i vasi xilematici provocando clorosi nelle nervature delle foglie dei giovani germogli, seguita da filloptosi, decolorazione del legno, necrosi e progressivo disseccamento dell'intera pianta. Ad oggi, nessun mezzo agronomico o chimico si è dimostrato efficace nel contenere la diffusione del patogeno, né i programmi di miglioramento genetico hanno raggiunto gli obiettivi di decifrare i meccanismi genetici di resistenza al patogeno e di sviluppare nuove varietà in cui si manifestasse sia il carattere di ottima qualità del frutto, che la tolleranza al mal secco. Una popolazione segregante di li-mone (125 individui) è stata ottenuta incrociando la varietà di limone ‘Interdonato’ (parentale femminile), tollerante al mal secco, con il limone ‘Femminello Siracusano 2Kr’ (parentale maschile), che produce frutti di buona qualità ma è anche altamente suscettibile al mal secco, ed è stata impiegata per uno studio di associazione genotipo-fenotipo volto all'identificazione di marcatori molecolari legati alla resistenza al mal secco. Il comportamento della popolazione full-sib nei confronti dell'infezione da mal secco è stato monitorato dopo l'inoculazione artificiale del patogeno, attraverso un approccio che prevede la valutazione visiva dei sintomi. La presenza del patogeno nei tessuti sintomatici è stata quindi esaminata mediante amplificazione in Real Time PCR e con l’isolamento in vitro. In alcuni genotipi di agrumi considerati come riferimento, inoltre, sono stati condotti anche studi istologici per indagare in modo più approfondito la resistenza al mal secco e hanno rivelato una correla-zione tra la densità dei vasi xilematici e la suscettibilità alla malattia. Sfruttando il recente sequenziamento de novo del genoma di limone, la popolazione full-sib è stata genotipizzata attraverso l'approccio SPET (Single Primer Enrichment Technology) e l'analisi QTL sugli SNPs selezionati ha condotto all'identificazione di regioni genomiche significativamente associate alla resistenza al mal secco. Tali regioni sono state annotate in silico e l'analisi ontologica ha evidenziato il loro coinvolgimento nella risposta di difesa all'attacco di funghi e alle ferite. Poiché la popolazione segregante di limone è stata naturalmente attaccata dal ragnetto rosso (Tetranychus urticae Koch), un acaro fitofago molto dannoso e di difficile controllo, e ha mostrato un'ampia gamma di sintomi nell’ambito dei diversi genotipi che la costituiscono, è stato considerato anche lo studio della risposta delle piante all’attacco di questo acaro. Per fare ciò, un saggio biologico è stato sviluppato ad hoc utilizzando foglie staccate poste in apposite arene sperimentali e l’analisi QTL è stata estesa anche per il carattere di resistenza all’attacco di ragnetto rosso. Tra i geni annotati in silico, è stato identificato quello codificante per l'eugenolo, un composto volatile dalle ben note forti proprietà acaricide. Ciò dimostra che, anche se la popolazione full-sib è stata costituita per uno scopo specifico, potrebbe essere utile anche per lo studio di molti altri caratteri agronomici di interesse (es. resistenza ad altri patogeni e parassiti, qualità dei frutti, spinescenza, poliembrionia, ecc.). In sintesi, sono stati messi a punto i protocolli di fenotipizzazione per la valutazione della suscettibilità su larga scala al mal secco e per l'attacco di ragnetto rosso, e sono stati identificati con successo alcuni geni candidati associati alla resistenza a entrambi gli stress biotici. Nel prossimo futuro, i risultati della presente ricerca saranno implementati nella Selezione Assistita da Marcatori (SAM) e negli esperimenti di genome editing, al fine di migliorare l'efficacia, in termini di costi e tempi, dei programmi di miglioramento genetico del limone.