Nanostrutture Luminescenti per Biosensing e Bioimaging

Thanks to the various applications in diagnosis and therapy (teragnostics) and biosensing, in recent years fluorescent nanoparticles have aroused increasing interest in the scientific community. For this purpose, two types of fluorescent nanoparticles were synthesized: lanthanide doped Y2O3 NPs and Au NCs. After having synthesized and extensively characterized both types of nanoparticles, we focused on the biological applications of Au NCs. The electrostatic interactions of Au NCs with synthetic (liposomes) and biological membranes (extracellular vesicles) were investigated, finding that, in case of NCs defect compared to lipids, Au NCs are positioned between the polar heads of membrane phospholipids without inducing perturbations. In addition to this external interaction study, the NCs were efficiently encapsulated within the liposomes (GUVs, LUVs and SUVs) mentioned above, using innovative encapsulation techniques for drug delivery applications. Subsequently, to test the targeting capacity of NCs, they were functionalized in a different way for the labeling of exosomes and more complex systems such as cells. After analyzing the entire EVs population within both healthy and pathological follicular fluids (FF), to allow the specific labeling of exosomes, the NCs were functionalized with the AntiCD81 antibody, obtaining a labeling that seems to be confirmed by CryoTEM micrographs. On more complex systems such as cells, the NCs were functionalized with a recognition segment (C3E6U11) capable of binding to a membrane receptor (Upar) overexpressed in pancreatic cancer cells (PANC1). The NCs efficiently labeled cancer cells not only by positioning themselves on the membrane but managing to be internalized inside the cell and also inside the nucleus, through a process of endocytosis, probably mediated by the Upar receptor, without generating toxic effects. Finally, biocompatibility on complete organisms such as Zebrafish was tested. The NCs did not generate significant toxic effects in this organism and no internalization was observed. It will be possible to proceed in the future to micro-injection experiments in zebrafish to see the effects of toxicity and the biodistribution of NCs within the fish. These and many other studies could be carried out to investigate the various applications of such nanoparticles, as well as to explore the possible biological applications and interactions of lanthanide doped Y2O3 NPs: they have, unlike NCs, a stable fluorescence even under electron beam, allowing their use in cathodoluminescence, in addition to upconvesion properties, highly sought after for biological applications.

Grazie alle svariate applicazioni in diagnosi e terapia (teragnostica) e biosensing, negli ultimi anni le nanoparticelle fluorescenti hanno suscitato crescente interesse nella comunità scientifica. A tale scopo sono state sintetizzate due tipi di nanoparticelle fluorescenti: lanthanide doped Y2O3 NPs e Au NCs. Dopo aver sintetizzato e ampiamente caratterizzato entrambi i tipi di nanoparticelle, ci si è concentrati sulle applicazioni biologiche degli Au NCs. Le interazioni degli Au NCs con le membrane sintetiche (liposomi come GUVs, LUVs e SUVs) e biologiche di vescicole extracellulari sono state studiate, riscontrando che, in caso di difetto rispetto ai lipidi, gli Au NCs si posizionano tra le teste polari dei fosfolipidi di membrana senza indurre perturbazioni. Oltre allo studio di interazione esterna, i NCs sono stati incapsulati in modo efficiente all’interno dei liposomi sopra citati tramite tecniche di incapsulazione innovative per applicazioni di drug delivery. Successivamente per testare la capacita di targeting dei NCs, essi sono stati funzionalizzati in modo differente per il labelling di esosomi e di sistemi più complessi come le cellule. Dopo aver analizzato l’intera popolazione di EVs all’interno del fluido follicolare (FF) sia sano che patologico, per permettere il labelling specifico di esosomi, i NCs sono stati funzionalizzati con l’anticorpo AntiCD81, ottenendo un marcaggio che sembra essere confermato tramite le immagini CryoTEM. Su sistemi più completi come le cellule, si è pensato di funzionalizzare i NCs con un segmento di riconoscimento (C3E6U11) capace di legarsi ad un recettore di membrana (Upar) sovraespresso nelle cellule tumorali pancreatiche (PANC1). I NCs hanno marcato efficientemente le cellule tumorali non solo posizionandosi sulla membrana ma riuscendo ad essere internalizzati dentro la cellula e addiruttura dentro al nucleo, tramite un processo di esndocitosi, probabilmente mediata dal recettore Upar, senza generare effetti di tossicita. In fine la biocompatibilita su organismi completi come Zebrafish è stata testa. I NCs non hanno generato effetti significativi di tossicità su questo tipo di organismo, e nessuna internalizzazione delle particelle e stata osservata. Sarà possibile procedere in futuro a esperimenti di microiniezione negli Zebrafish per vedere gli effetti della tossicità e la biodistribuzione dei NCs all'interno del pesce. Questi e molti altri studi potrebbero essere condotti per indagare le varie applicazioni di tali nanoparticelle, nonché per esplorare le possibili applicazioni biologiche e le interazioni delle Y2O3 NPs drogate con lantanidi: esse hanno, a differenza dei NCs, una fluorescenza stabile anche sotto fascio elettronico, consentendo il loro utilizzo in catodoluminescenza, oltre alle proprietà di upconvesion, molto ricercate per applicazioni biologiche.