Identificazione del pattern di espressione dei microRNA nei pazienti con cancro del colon-retto e sua modulazione favorevole dopo l'arricchimento del microbiota intestinale con i probiotici

Colorectal cancer (CRC) represents the third most commonly diagnosed tumor and the second cause of cancer-related death worldwide. Despite diagnostic and therapeutic advances, the mortality rates of CRC remain high, especially in industrialized countries. Numerous studies have demonstrated how several factors are involved in the development and progression of CRC. Among these, epigenetic modifications and intestinal microbiota seems to play a pivotal role in the pathogenesis of CRC, however, the precise mechanisms driven by epigenetic factors, like microRNAs (miRNAs), and gut microbiota have not been fully elucidated yet. Notably, gut microbiota is considered a real neglected organ. In the last decade, several pre-clinical and clinical studies performed by using novel high-throughput technologies (i.e., metagenomics, metatranscriptomics, metabolomics), have allowed the identification of a crosstalk between gut microbiota and cancer, especially in patients with CRC, demonstrating how specific bacteria may increase the risk of development of tumors. In this context, it was also demonstrated that eubiotic microbiota exerts protective mechanisms against the detrimental effects of carcinogens as well as reduce the side effects of pharmacological therapies (e.g., diarrhea, mucositis, etc.) in cancer patients. As regards miRNAs, several studies have tried to identify miRNAs specifically associated with the presence of CRC or with the prognosis of this tumor, however, very confusing data have been generated and no reliable biomarkers are currently recognized effective in diagnosing this tumor. Therefore, although a great interest is currently devoted on both miRNAs and gut microbiota as potential indicators and predictors of CRC development, there is a lack of effective biomarkers for the early diagnosis of this tumor which suggest the need of further investigations about these two promising topics. On these bases, the aim of the present study was to further establish the potential diagnostic and prognostic role of miRNAs in CRC as well as the impact of gut microbiota and its modulation in the expression levels of miRNAs known to be involved in the development and progression of this tumor. For these purposes, first, computational analyses were performed by analyzing miRNA expression profile of CRC patients by using the data contained in the Gene Expression Omnibus DataSets (GEO DataSets) and The Cancer Genome Atlas databases (TCGA). Unlike other similar bioinformatics studies, in this study an integrated computational analysis was performed by considering all the relevant microarray miRNA expression datasets on CRC patients and the miRNA-seq data of GEO DataSets and TCGA databses. Through these analyses, it was possible to identify a list of miRNAs associated with the development of CRC. Further bioinformatics analyses performed by using different prediction tools allow us to establish the functional role of the selected miRNAs in CRC. Among the miRNAs identified, four different miRNAs, i.e. hsa-miR-21-5p, hsa-miR-503-5p, hsa-miR-497-5p and hsa-miR-375, were selected for the validation analyses on CRC tissue and liquid biopsy samples and as miRNAs potentially modulated by the modification of gut microbiota obtained through probiotic enrichment. From an experimental point of view, the dysregulation of the expression levels of the four selected miRNAs were evaluated in both liquid biopsy samples and Formalin-Fixed Paraffin Embedded (FFPE) tissue samples and adjacent normal mucosa obtained from CRC patients. For these validation analyses, the high-sensitive droplet digital PCR (ddPCR) amplification systems was used. The ddPCR analyses performed on CRC FFPE samples and normal mucosa confirmed the preliminary computational data showing the strong up-regulation of the two predicted overexpressed miRNAs, hsa-miR-21-5p and hsa-miR-503-5p, and the significant down-regulation of the two predicted down-regulated hsa-miR-497-5p and hsa-miR-375. As regards the analysis of liquid biopsy samples, only two miRNAs were significantly dysregulated in CRC patients compared to healthy donors. Indeed, according to the computational results previously obtained, circulating hsa-miR-21-5p resulted up-regulated while the hsa-miR-497-5p was down-regulated in CRC patients. The high diagnostic significance of the selected miRNAs was further confirmed by performing Receiver Operating Characteristic (ROC) analyses. Regarding the modulating effects induced by probiotics and microbiota enrichment in the expression levels of miRNAs another GEO DataSets platform containing miRNA expression levels in samples before and after probiotic intervention was analyzed. By merging the list of miRNAs involved in CRC with those modulated by probiotics intervention, we confirmed the involvement of the previous analyzed miRNAs in CRC. Finally, to validate the modulating potential of probiotics intervention, the expression levels of the three selected miRNAs were investigated on liquid biopsy samples of CRC patients before and after three months of Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) probiotic administration selected within the participants of a clinical trail on the “Maintenance of normal gastro-intestinal function with dietary supplement containing Lactobacillus rhamnosus GG in cancer patients treated with cytotoxic chemotherapy and/or targeted therapy”. These further analyses confirmed the modulatory effects of LGG on the expression levels of miRNAs involved with the development and progression of CRC. Overall, this study represents the starting point for the adoption of miRNAs and probiotics for the management of CRC. More in detail, after miRNA validation in a wider cohort of CRC patients, the miRNAs hsa-miR-21-5p, hsa-miR-503-5p, hsa-miR-497-5p and hsa-miR-375 could be proposed as novel and high-sensitive biomarkers for the diagnosis of CRC. In addition, the data here obtained confirm the direct and indirect beneficial effects of probiotics administration in CRC patients by reducing the gastrointestinal toxicity of chemotherapy and inducing positive modulations of miRNAs involved in CRC progression. Finally, the data here obtained strongly encourage the use of ddPCR as an effective and sensitive analytical method to evaluate the expression levels of miRNAs both in tissues and liquid biopsy samples. This high-sensitive strategy could be applied for the development of novel effective screening programs and for the construction of novel diagnostic card or platform useful for the non-invasive and early diagnosis of CRC in individuals at risk for this tumor.

Il cancro del colon-retto (CRC) rappresenta il terzo tumore più frequentemente diagnosticato e la seconda causa di morte per tumore in tutto il mondo. Nonostante i progressi diagnostici e terapeutici, i tassi di mortalità del CRC rimangono elevati, soprattutto nei paesi industrializzati. Numerosi studi hanno dimostrato come diversi fattori possono essere coinvolti nello sviluppo e nella progressione del CRC. Tra questi, le modificazioni epigenetiche e il microbiota intestinale sembrano svolgere un ruolo fondamentale nella patogenesi del CRC, tuttavia, i meccanismi alla base dell’interazione tra i fattori epigenetici, come i microRNA (miRNA) e il microbiota intestinale nei confronti del CRC non sono stati ancora completamente chiariti. Nell'ultimo decennio, diversi studi preclinici e clinici condotti utilizzando nuove tecnologie ad alto rendimento (ad esempio, metagenomica, metatrascrittomica, metabolomica), hanno permesso l'identificazione di un crosstalk tra microbiota intestinale e cancro, specialmente nei pazienti con CRC, dimostrando come specifici batteri possono aumentare il rischio di sviluppo di tumori. In questo contesto, è stato anche dimostrato che il microbiota eubiotico esercita meccanismi protettivi contro gli effetti dannosi degli agenti cancerogeni e riduce gli effetti collaterali delle terapie farmacologiche (ad es. Diarrea, mucosite, ecc.) nei pazienti oncologici. Per quanto riguarda i miRNA, diversi studi hanno cercato di identificare miRNA specificamente associati alla presenza di CRC o alla prognosi di questo tumore, tuttavia sono stati generati dati molto confusi ed attualmente non sono riconosciuti biomarcatori affidabili ed efficaci nella diagnosi del CRC. Pertanto, sebbene sia attualmente dedicato un grande interesse sia ai miRNA che al microbiota intestinale come potenziali indicatori e predittori dello sviluppo di CRC, mancano biomarcatori efficaci per la diagnosi precoce di questo tumore che suggeriscono la necessità di indagare ulteriormente sul ruolo dei miRNA e del microbiota intestinale nel CRC. Su queste basi, lo scopo del presente studio è stato quelli di stabilire ulteriormente il potenziale ruolo diagnostico e prognostico dei miRNA nel CRC, nonché l'impatto del microbiota intestinale e la modulazione indotta da quest’ultimo sui livelli di espressione dei miRNA noti per essere coinvolti nello sviluppo e nella progressione di questo tumore. A tale scopo, sono state eseguite diverse analisi computazionali analizzando il profilo di espressione di miRNA dei pazienti con CRC utilizzando i dati contenuti nei database Gene Expression Omnibus DataSets (GEO DataSets) e The Cancer Genome Atlas (TCGA). A differenza di altri studi bioinformatici, in questo studio è stata eseguita un'analisi computazionale considerando tutti i set di dati microarray di espressione di miRNA rilevanti su pazienti con CRC e i dati di miRNA-seq contenuti in GEOdataset e TCGA. Attraverso queste analisi è stato possibile identificare un elenco di miRNA associati allo sviluppo di CRC. Ulteriori analisi bioinformatiche eseguite ci hanno inoltre permesso di stabilire il ruolo funzionale dei miRNA selezionati nel CRC. Tra i miRNA identificati, quattro diversi miRNA, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-503-5p, hsa-miR-497-5p e hsa-miR-375, sono stati selezionati per le successive analisi di validazione su campioni FFPE e su campioni di biopsia liquida e come miRNA potenzialmente modulati dalla modificazione del microbiota intestinale ottenuta attraverso l'arricchimento probiotico. Successivamente, tramite la metodica di amplificazione ad alta sensibilità Droplet Digital PCR (ddPCR) è stato possibile valutare la disregolazione dei livelli di espressione dei quattro miRNA selezionati sia in campioni di biopsia liquida che in campioni di tessuto paraffinato (FFPE) di tumore e mucosa normale adiacente ottenuti da pazienti con CRC. Le analisi ddPCR eseguite su campioni FFPE di CRC e mucosa normale hanno confermato i dati computazionali preliminari nei quali si è evidenziato un forte incremento dei due miRNA up-regolati, hsa-miR-21-5p e hsa-miR-503-5p, e un significativo decremento dei due miRNA down-regolati hsa-miR-497-5p e hsa-miR-375 . Per quanto riguarda l'analisi dei campioni di biopsia liquida, solo due miRNA sono risultati essere significativamente disregolati nei pazienti con CRC rispetto ai controlli sani. Infatti, secondo i risultati computazionali precedentemente ottenuti, i livelli circolanti di hsa-miR-21-5p risultavano essere up-regolati mentre quelli di hsa-miR-497-5p down-regolati nei pazienti con CRC rispetto ai controlli sani. Il possibile ruolo diagnostico dei miRNA selezionati è stato ulteriormente confermato tramite analisi ROC (Receiver Operating Characteristic). Per quanto riguarda la valutazione degli effetti modulanti indotti dai probiotici e dall'arricchimento del microbiota nei confronti dei livelli di espressione dei miRNA, è stata analizzata un'altra piattaforma GEO DataSets contenente i livelli di espressione dei miRNA prima e dopo somministrazione di probiotici. Unendo l'elenco dei miRNA coinvolti nel CRC con quelli modulati dai probiotici, abbiamo confermato il coinvolgimento dei miRNA precedentemente analizzati nel CRC. Infine, per convalidare il potenziale effetto modulante dato dai probiotici, i livelli di espressione di tre miRNA selezionati sono stati studiati su campioni di biopsia liquida di pazienti con CRC prima e dopo tre mesi di somministrazione di probiotici Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) selezionati all'interno dei partecipanti di un traial clinico “Maintenance of normal gastro-intestinal function with dietary supplement containing Lactobacillus rhamnosus GG in cancer patients treated with cytotoxic chemotherapy and/or targeted therapy”. Queste ulteriori analisi hanno confermato gli effetti modulatori di LGG sui livelli di espressione dei miRNA coinvolti nello sviluppo e nella progressione del CRC. Nel complesso, questo studio rappresenta il punto di partenza per l'adozione di miRNA e probiotici per la gestione del CRC. In particolare, dopo la convalida dei miRNA in una coorte più ampia di pazienti con CRC, i miRNA hsa-miR-21-5p, hsa-miR-503-5p, hsa-miR-497-5p e hsa-miR-375 possono essere proposti come possibili nuovi biomarcatori ad alta sensibilità per la diagnosi di CRC. Inoltre, i dati qui ottenuti confermano gli effetti benefici diretti e indiretti della somministrazione di probiotici nei pazienti con CRC riducendo la tossicità gastrointestinale della chemioterapia e inducendo modulazioni positive dei miRNA coinvolti nella progressione del CRC. Infine, i dati ottenuti incoraggiano fortemente l'uso della ddPCR come metodo analitico efficace ed altamente sensibile per valutare i livelli di espressione dei miRNA sia nei tessuti che nei campioni di biopsia liquida. Questa strategia ad alta sensibilità potrebbe essere applicata per lo sviluppo di nuovi programmi di screening efficaci e per la costruzione di nuove piattaforme diagnostiche utili per la diagnosi precoce e non invasiva di CRC in individui a rischio per questo tumore.