Metodi tradizionali ed innovativi per l'identificazione di genotipi resistenti al Mal secco degli agrumi

Mal secco is the most severe disease that caused heavy yield losses to the Italian lemon industry. It is a tracheomycotic disease caused by the fungus Plenodomus tracheiphilus (Petri) Gruyter, Aveskamp & Verkley. Since the first reported disease in the Sicilian lemon orchards, the main goal for breeders and lemon growers was to identify lemon clones resistant to Mal Secco Disease (MSD). Different genetic improvement methods were used to obtain resistant plant material, but none of them had fully solved the problem. Some lemon (C. limon L. Burm. f.) clones with some degree of tolerance and high fruit quality have been selected (Femminello Zagara Bianca, Femminello Continella), but these selections usually get infected in many growing area with high pressure of the pathogen. Consequently, growers can only use Monachello, a clone having high tolerance to the disease but also low fruit quality. This lemon clone has guaranteed the survival of lemon orchards in many areas afflicted by the disease, but it does not guarantee the Italian lemon industry's competitivity. The project's main goal was identify sources of tolerance and resistance to the disease in the citrus germplasm and to enhance the knowledge about the genes involved in MSD tolerance, resistance, and sensitivity. Two approaches were used, based on traditional techniques and transcriptomic analysis. A phenotypic survey based on the evaluation of the different level of tolerance or resistance to MSD, has been performed in a germplasm field planted at CREA, Italy, in an area of high pathogen pressure and was combined with a molecular screening for the presence of the pathogen based on real-time PCR. The results revealed sources of tolerance in lemon and citron hybrids. The molecular screening identified P. tracheiphilus in all lemon clones and clones without apparent symptoms, indicating their ability to tolerate the disease. This project also provided a reliable method for MSD detection by Real time PCR analysis by which a significant correlation with disease symptoms was calculated. Based on the survey result, we selected the most suitable parents to generate two segregating populations to introduce the putative resistance genes in lemon genotypes, which may help to detect possible Quantitative Trait Loci (QTLs) associated with the resistance to MSD. Using Simple Sequence Repeats (SSRs) molecular markers, these populations were screened to verify the parentage of the progenies and discard the F1 hybrids derived from selfing. A genome-wide mapping of QTLs controlling the resistance to MSD will be a desirable tool to use in the next years, with the final purpose to identify the most valuable molecular markers suitable for marker-assisted selection (MAS) in the breeding programs. With the main aim of identifying candidate genes involved in the defence response of citrus plants to MSD, we performed a de novo transcriptome analysis of rough lemon (Citrus jambiri Lush.) seedlings subjected to artificial inoculations of P. tracheiphilus in comparison with plants inoculated with water. Under fungus challenge, the rough lemon seedlings significantly down-regulated the genes involved in the light-harvesting and the photosynthetic electron flow, thus probably inducing a shortage of energy for cellular functions. Moreover, the systemic acquired resistance (SAR) is activated through the induced salicylic acid cascade, probably preparing the plants to a successive pathogen attack. Interestingly, RPM1 interacting protein 4, an essential positive regulator of plant defence, and BIR2, which is a negative regulator of the basal level of immunity (namely PTI, pathogen-associated molecular patterns triggered immunity) have been identified thus representing useful targets genes for future breeding. The identification of candidate genes involved in plant -pathogen interaction could be useful for future biotechnological approaches. In particular, the application of new plant breeding techniques (NPBTs), specifically genome editing and cisgenesis, can offer an alternative to conventional breeding strategies to modify resistance or susceptibility genes in high-quality, susceptible lemon varieties.

Il Mal secco degli agrumi è la più grave micopatia che colpisce il limone (C. limon L. Burm. f.) ed è causa di ingenti perdite di produzioni alla limonicoltura italiana. L’agente patogeno della malattia è il fungo Plenodomus tracheiphilus (Petri) Gruyter, Aveskamp & Verkley. Il principale obiettivo per i breeder e per i limonicoltori, fin dalla prima segnalazione della malattia nei limoneti siciliani, è stato quello di identificare cloni di limone resistenti al Mal secco degli agrumi (MSD). Differenti metodi di miglioramento genetico sono stati utilizzati, ma nessuno di essi fino ad oggi ha permesso di raggiugere i risultati sperati. Infatti, sebbene qualche varietà di limone meno suscettibile alla malattia e con buone caratteristiche produttive sia stata selezionata (Femminello Zagara Bianca, Femminello Continella), in alcuni areali l’alta pressione del patogeno ha consentito agli agrumicoltori il solo utilizzo del Monachello, un clone di limone che ha garantito la sopravvivenza della limonicoltura nelle aree severamente afflitte dalla malattia ma che non ha assicurato, per le sue mediocri caratteristiche qualitative, competitività alla limonicoltura italiana. Il principale obiettivo del progetto è stato identificare sorgenti di tolleranza e resistenza alla malattia in germoplasma di agrumi ed implementare le conoscenze sui geni coinvolti nella resistenza, tolleranza o sensibilità al MSD. Sono stati utilizzati due approcci, basati su tecniche tradizionali di miglioramento genetico e sull’analisi trascrittomica. L’indagine è stata effettuata nel campo di germoplasma del CREA di Acireale, Italia, in un’area con un’alta pressione del patogeno. I genotipi in collezione sono stati sottoposti ad analisi di fenotipizzazione dei sintomi della malattia, e alla diagnosi molecolare, tramite Real-time PCR, per la valutazione della presenza del patogeno. L’analisi molecolare ha permesso di diagnosticare il patogeno in tutti i cloni di limone, anche in quei cloni senza chiari sintomi, indicando la loro attitudine a tollerare la malattia stessa. Inoltre, questo lavoro, combinando due tecniche analitiche, fenotipizzazione e diagnosi molecolare, fornisce un valido metodo per la valutazione della presenza del MSD, infatti la correlazione calcolata tra le due variabili ottenute è risultata significativa. In base ai risultati dell’indagine fenotipica, sono stati selezionati i parentali più adatti a generare due popolazioni segreganti, con la possibilità di indentificare dei QTLs (Quantitative Trait Locus) relativi alla resistenza al patogeno. Queste popolazioni, grazie all’utilizzo di marcatori molecolari SSRs (Simple Sequence Repeats), sono state analizzate in modo da eliminare tutti gli ibridi F1 derivanti dall’autoimpollinazione del parentale femminile. La mappatura dei QTLs che controlla la resistenza al MSD sarà uno strumento utile, da utilizzare nei prossimi anni, con lo scopo di identificare quei marcatori molecolari adatti ad essere utilizzati nella selezione assistita da marcatori (MAS) per i programmi di breeding. Con l’obiettivo di identificare i principali geni candidati coinvolti nella riposta difensiva al MSD, è stata effettuata un’analisi de novo del trascrittoma di semenzali di limone rugoso (Citrus jambiri Lush.) confrontando piante inoculate con P. tracheiphilus e piante controllo inoculate con acqua. I principali risultati di questo studio hanno evidenziato che, a causa del patogeno, il limone rugoso ha significativamente sottoespresso i geni coinvolti nella fase luminosa della fotosintesi, probabilmente inducendo una carenza di energia per le funzioni cellulari. In aggiunta, la resistenza sistemica acquisita (SAR) è stata indotta attraverso la cascata di reazioni attivate dall’ acido salicilico, probabilmente nel tentativo di preparare le piante ad un successivo attacco del patogeno. È interessante notare, come la RPM1 interacting protein 4, un regolatore essenziale che favorisce la difesa delle piante, e BIR2, un altro regolatore che modifica negativamente il livello basale di immunità (chiamato PTI, pathogen-associated molecular patterns triggered immunity) siano stati identificati, rappresentando obiettivi utili per il miglioramento genetico del limone. L’identificazione di geni candidati coinvolti nell’interazione ospite-patogeno potrebbe essere utile in futuri approcci biotecnologici. In particolare, l'applicazione di nuove New Plant Breeding Techniques (NPBTs), genome editing e cisgenesis, possono offrire dei metodi alternativi per l’ottenimento di genotipi di limone resistenti al MSD.