Nanomateriali funzionalizzati con l'angiogenina e frammenti peptidici mimanti la sua attività biologica per il trattamento del cancro e delle ferite cutanee

In the last few years, the application of nanomaterials (NMs) as medical devices has gained great interest among the researchers due to their several advantages compared to the conventional drugs, including improved efficacy, bioavailability, targeting ability and safety. Indeed, NMs, owing to their small size, can freely diffuse across the tissues, pass biological barriers and mediate molecular interactions. Moreover, NMs can be efficiently loaded with active molecules, to protect against enzymatic degradation and to allow for their efficient trafficking to the target site. According to such premises, this thesis deals with the synthesis and the physico-chemical characterization of hybrid organic/metallic nanomaterials at the interface with systems of biological interest (peptides, protein, lipid membranes, cells), specifically developed for the modulation of the angiogenic process, for application in cancer therapy and wound care. In particular, this work has been addressed to the synthesis and characterization of spherical gold nanoparticles (AuNPs) and AuNP-graphene oxide (Au-GO) nanoassemblies. These platforms have been functionalized with the protein angiogenin (ANG), one of the most powerful angiogenic factors as well as with peptide fragments able to mimic some biological activities of the whole protein. Also, the synergic/antagonist role of copper, another known angiogenic factor, which can bind to ANG thus influencing its biological response, has been investigated. The hybrid bio-interface between AuNP, GO, and ANG protein/peptides was scrutinized by a multi-technique approach which relies on spectroscopic techniques (UV-visible, dynamic light scattering, circular dichroism) and microscopic methods (atomic force microscopy, laser scanning confocal microscopy). The interaction with an artificial model of cell membrane, i.e., supported lipid bilayers, was inspected by means of the acoustic sensing technique Quartz Crystal Microbalance with Dissipation monitoring and by fluorescence recovery after photo-bleaching experiments. Cellular experiments were carried out to investigate the interaction with both tumour and healthy cells. Specifically human neuroblastoma (SH-SY5Y line), both undifferentiated and differentiated neuron-like cells, glioblastoma (A172 line), fibroblasts (MRC-5 and HFF1 lines) and endothelial (HUVEC line) cells were examined in their response towards the nanomaterials, in terms of cytotoxicity, cellular internalization, cell-migration and tubulogenesis. The AuNP-GO-ANG(protein/peptide)-Cu hybrids, by combining the antiangiogenic and antioxidant action of the colloidal gold, the angiogenic properties of copper ions, the antibacterial action of GO and with the biological activity of angiogenin, may provide promising applications for the angiogenesis modulation in cancer and wound care.

Le recenti applicazioni dei nanomateriali ai sistemi farmaceutici e alla medicina hanno permesso di superare i numerosi ostacoli associati alle terapie e ai farmaci convenzionali aumentandone la biocompatibilità, la biodisponibilità e l’efficacia garantendo un’azione mirata al sito attivo. Grazie alle loro dimensioni nanometriche, paragonabili a quelle delle macromolecole biologiche, i nanomateriali, infatti, hanno la capacità di attraversare le barriere fisiologiche e tissutali e di interagire direttamente con macromolecole organiche e strutture cellulari. I nanomateriali, inoltre, possono essere facilmente funzionalizzati con composti biologicamente attivi proteggendoli dai processi di degradazione enzimatica, aumentandone il tempo di emivita e permettendone un efficiente rilascio a specifiche cellule e tessuti. Considerati i vantaggi dell’uso delle nanotecnologie in medicina, il lavoro di questa tesi è stato focalizzato sulla sintesi e la caratterizzazione chimico-fisica di nanomateriali ibridi organici e metallici, all’interfaccia con sistemi di interesse biologico quali peptidi, proteine, membrane lipidiche e cellule, specificatamente sviluppati per modulare i processi angiogenici per applicazioni nella terapia antitumorale e nel trattamento delle ferite cutanee. In particolare, in questo lavoro sono state sintetizzate e caratterizzate nanoparticelle di oro sferiche (AuNP) e sistemi ibridi AuNP-grafene ossido (Au-GO). Queste nanopiattaforme sono state funzionalizzate con l’angiogenina (ANG), una proteina riconosciuta come uno dei principali fattori coinvolti nel processo di neo-vascolarizzazione, e frammenti peptidici di ANG mimanti alcune delle sue attività biologiche. Inoltre, è stato valutato il ruolo sinergico/antagonista del rame, noto per la sua attività angiogenica, e che è in grado di legare ANG influenzandone l’attività biologica. La bio-interfaccia ibrida tra AuNP, GO e ANG (proteina/peptide) è stata studiata mediante tecniche spettroscopiche, UV-visibile, dynamic light scattering (DLS), dicroismo circolare (CD) e tecniche di microscopia quali microscopio a forza atomica e microscopio confocale a scansione laser. L’interazione delle nanopiattaforme ibride sintetizzate, con bistrati lipidici supportati come sistemi di membrane biologiche modello, è stata studiata attraverso la tecnica di sensing acustico QCM-D e esperimenti di recupero della fluorescenza dopo photo-bleaching (FRAP). Infine, sono stati condotti esperimenti cellulari su linee tumorali e sane, specificatamente cellule di neuroblastoma (SH-SY5Y) indifferenziato e differenziato, come modello di cellule neuronali, glioblastoma (A172), fibroblasti (MRC-5 e HFF1) e cellule endoteliali (HUVEC), per studiare l’interazione dei nanosistemi in termini di citotossicità, capacità di internalizzazione, migrazione cellulare e formazione di strutture simil-capillari per valutarne le proprietà angiogeniche. Le nanopiattaforme ibride AuNP-GO-ANG(proteina/peptide)-Cu, combinando l’azione antiangiogenica e antiossidante dell’oro colloidale, le proprietà pro-angiogeniche degli ioni rame, l’azione antibatterica del GO e le proprietà biologiche di ANG hanno mostrato risultati promettenti nella modulazione dell’angiogenesi nel cancro e nel processo di riparazione delle ferite.