Regolazione trascrizionale delle isoforme VDAC umane: analisi dei loro profili di espressione, dell'attività del promotore e dei regolatori trascrizionali

VDACs (Voltage Dependent Anion-selective Channels) are pore-forming proteins located in the outer mitochondrial membrane where they mediate metabolic exchanges between cytosol and mitochondria. In higher eukaryotes, VDACs form a multigene family that includes three isoforms (VDAC1-3) encoded by three different nuclear genes. Despite remarkably similar in sequence and structure, recent evidences suggest different biological roles in both normal and pathological conditions for each isoform. A crucial aspect of VDAC research is to understand how the expression of these three genes is regulated under normal conditions or in response to external stimuli. Clarifying this aspect could be essential to shed light on the specific functions of each isoform. The aim of this PhD work was therefore to analyse the mechanism of transcriptional regulation of human VDAC genes. To this end, an analysis of VDAC expression profiles in different tissues was performed and the promoter structure and activity for each isoform was characterized. RNA-seq transcriptome analysis revealed a ubiquitous distribution of VDAC transcripts across human tissues, with VDAC1 and VDAC2 predominating over VDAC3. However, RNA-seq CAGE data obtained from the FANTOM5 project reported that the most highly expressed isoform is VDAC3, probably due to the higher transcriptional activity of its gene promoter. Indeed, both the RT-PCR results and the promoter activity assay confirmed that, although VDAC1 is the most abundant isoform, the VDAC3 gene promoter has a higher transcriptional activity. In addition, bioinformatic analysis of the VDAC promoters revealed the presence of binding sites for transcription factors involved in the regulation of cell proliferation, differentiation, apoptosis, and metabolism. A unique set of transcription factors was also defined for each isoform, highlighting their possible involvement in specific cellular processes. Finally, the regulatory mechanism of VDAC1 during metabolic stress induced by nutrient deprivation and hypoxia was studied. In this context of metabolic adaptation, the expression of VDAC1 and its promoter activity were significantly increased. We have also shown that NRF-1 and HIF-1α factors contribute to the modulation of VDAC1 promoter activity under these stress conditions.

I VDAC (Voltage Dependent Anion-selective Channels) sono proteine canale localizzate nella membrana mitocondriale esterna dove mediano principalmente gli scambi metabolici tra citosol e mitocondri. Negli eucarioti superiori, i VDAC formano una famiglia multigenica che include tre isoforme (VDAC1-3) codificate da tre diversi geni nucleari. Nonostante esse condividano un’elevata similarità nella sequenza e nella struttura, studi funzionali fatti negli ultimi anni sulle proteine VDAC suggeriscono che ciascuna isoforma svolga ruoli biologici diversi all’interno della cellula. Un aspetto cruciale della ricerca sui canali VDAC è comprendere come l'espressione di questi tre geni venga regolata in condizioni normali o in risposta a stimoli esterni. Chiarire questo aspetto potrebbe essere essenziale per far luce sulle specifiche funzioni di ogni singola isoforma. Lo scopo di questo lavoro di dottorato è stato pertanto quello di analizzare il meccanismo di regolazione trascrizionale dei geni VDAC umani attraverso la caratterizzazione dei loro profili di espressione in diversi tessuti, della struttura dei loro promotori genici e della distribuzione dei siti di legame per fattori di trascrizione comuni o specifici per ciascuna isoforma. L'analisi dei profili di espressione dei geni VDAC ha rivelato una distribuzione perlopiù ubiquitaria dei trascritti delle tre isoforme, con una predominanza di VDAC1 e VDAC2 rispetto a VDAC3. Tuttavia, i dati di RNA-seq CAGE ottenuti dal progetto FANTOM5 riportano che l’isoforma maggiormente espressa è VDAC3, probabilmente a causa della maggiore attività trascrizionale del suo promotore genico. Infatti, sia i risultati di RT-PCR e che il saggio di attività del promotore hanno confermato che, sebbene VDAC1 sia l'isoforma più abbondante, il promotore del gene VDAC3 presenta un’attività trascrizionale più elevata. Inoltre, dall'analisi bioinformatica dei promotori VDAC è emersa la presenza di siti di legame per fattori di trascrizione coinvolti nella regolazione dei processi di proliferazione cellulare, differenziazione, apoptosi e nel metabolismo. Per ogni isoforma è anche stato definito un set unico di fattori di trascrizione che ha consentito di evidenziare il loro possibile coinvolgimento in specifici processi cellulari. Infine, è stato studiato il meccanismo di regolazione di VDAC1 durante stress metabolici indotti da deprivazione di nutrienti e ipossia. In questo contesto di adattamento metabolico l’espressione di VDAC1 e l’attività del suo promotore aumentano in maniera significativa. Abbiamo inoltre dimostrato che i fattori NRF-1 e HIF-1α contribuiscono alla modulazione dell’attività del promotore VDAC1 in queste condizioni di stress.