Selezione di comunità batteriche endofite, geni e metaboliti secondari per la coltivazione sostenibile del pomodoro in serra

This thesis project aimed to acquire the bases for biotechnological interventions on the tomato microbiome in order to improve growing conditions of the crop its resistance and resilience to stresses and the characteristics that lead to the formation of quality itself in the perspective of sustainable agriculture focused to the protection of the environment and the consumer. Tomato belongs to the Solanaceae family and is the second most important fruit or vegetable crop next to potato. The intensive management required to mitigate serious economic losses, has encouraged the search of alternative approaches for the control of tomato diseases, including the use of biological control agents. In our model study we used different approaches to study microbial communities of tomato root compartments in a real-word environment represented by an intensive tomato cultivation area characterized by extra-seasonal productions in the greenhouse. A metagenomics approach by amplicon sequencing was used for a comprehensive and systematic evaluation of the community structure and composition related to the formation and composition of the bacterial and fungal tomato communities in commercial conditions from nursery production materials to greenhouse commercial materials. The analysis revealed substantial differences in the composition and the assembly of microbial communities in tomatoes grown in agricultural soil or in cultivation outside soil using a coconut fibre substrate, even if they come from the same batch of seeds and seedlings nursery here also analysed. In particular, microbial communities of soilless grown plants appeared to be affected by bacterial communities formed in the nursery, while plants grown in agricultural soil in a short time have been affected by it. Although in recent years the advances in next-generation omics technologies have led to the possibility of revealing plant-associated microbiomes, culture-dependent methods are still necessary to bioprospect natural diversity as a source of new tools for sustainable agriculture. The cultivation approach was therefore applied to explore and compare the natural biodiversity of tomato root-associated bacterial communities in farms with plants grown in agricultural soil and form the endosphere from seeds and roots of plants at different stage of growth and grown in different cultivation systems (i.e. the samples analysed with the metagenomic approach). In both experiment a phenotyping scheme based on the analysis of traits correlated Plant Growth Promotion and Biocontrol activity was applied. More than 500 characterized bacterial isolates were analysed and constitute a biobank for further work. More than 100 strains were assigned to a known taxon by 16S rRNA gene (rDNA) sequencing. In planta activity against phytopathogenic bacteria of a subset of Bacillus and Pseudomonas isolates was also assessed. The draft genome sequences of two Pseudomonas strains were also obtained.

Questo progetto di tesi mira ad acquisire le basi per interventi biotecnologici sul microbioma del pomodoro al fine di migliorare le condizioni di crescita della coltura, la sua resistenza agli stress biotici e abiotici, e l’incremento delle caratteristiche che portano alla formazione della qualità stessa della coltura, in una prospettiva di agricoltura sostenibile incentrata sulla protezione dell'ambiente e dei consumatori. Il pomodoro appartiene alla famiglia delle Solanaceae ed è la seconda coltura ortofrutticola più importante accanto alla patata. La gestione intensiva necessaria per mitigare gravi perdite economiche, ha incoraggiato la ricerca alla ricerca di approcci alternativi per il controllo delle malattie del pomodoro, compreso l'uso di agenti di controllo biologico. Nel nostro modello di studio abbiamo utilizzato diversi approcci per studiare le comunità microbiche dei compartimenti radicali del pomodoro in un ambiente reale rappresentato da un'area di coltivazione intensiva della coltura caratterizzata da produzioni extra-stagionali in serra. Un approccio metagenomico è stato utilizzato per una valutazione completa e sistematica della struttura delle comunità batteriche e fungine del pomodoro, della loro composizione e formazione in condizioni commerciali, dalla produzione vivaistica alla loro commercializzazione in serra. L'analisi ha rivelato differenze sostanziali nella composizione delle comunità microbiche del pomodoro coltivato in serra in due diversi sistemi di coltivazione, in suolo agrario o in coltura “fuori suolo” utilizzando come substrato sacchi di fibra di cocco, anche se le piante provenivano dalla stessa partita di sementi e piantine in vivaio, anch’essi analizzati. In particolare, le comunità microbiche delle piante coltivate fuori suolo sembravano ospitare comunità batteriche simili a quelle presenti nelle piantine in vivaio, mentre le piante coltivate in suolo agrario in breve tempo hanno subito l’influenza del suolo stesso. Anche se negli ultimi anni i progressi nelle tecnologie “omiche” di nuova generazione hanno portato alla possibilità di conoscere i microrganismi associati alle piante, i metodi coltura-dipendenti sono ancora necessari per la bio-prospezione della diversità naturale come fonte di nuovi strumenti per l'agricoltura sostenibile. L'approccio colturale è stato quindi applicato per esplorare e confrontare la biodiversità naturale della frazione coltivabile delle comunità batteriche associate al pomodoro. Sono stati analizzati i compartimenti radicali di piante provenienti da aziende agricole diverse, coltivate in suolo agrario, e l'endosfera di semi e radici di piante in diversi stadi di crescita e coltivate in diversi sistemi di coltivazione (ad es. i campioni analizzati con l'approccio metagenomico). In entrambi gli esperimenti è stato applicato uno schema fenotipico basato sull'analisi dei tratti correlati Plant Growth Promotion e Biocontrol activity. Più di 500 isolati batterici sono stati analizzati e costituiscono una collezione per ulteriori lavori. Più di 100 ceppi sono stati identificati tramite sequenziamento del gene 16S rRNA (rDNA). Un sottoinsieme di batteri isolati appartenenti ai generi Pseudomonas e Bacillus sono stati valutati in vivo nei confronti di batteri fitopatogeni del pomodoro. Sono state inoltre ottenute anche le sequenze genomiche di due ceppi di Pseudomonas isolati e selezionati per le loro capacità in vivo e in vitro.