Ruolo del lattato e della proteina Insulin-Like Growth Factor Binding Protein 6 nel Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma Multiforme (GBM) is the most common and most malignant primary brain tumor of the Central Nervous System (CNS) in the adults. It represents half of the newly diagnosed gliomas, and despite the aggressive therapeutic regimen, the median patient survival is about only 14-17 months after diagnosis. Tumor microenvironment (TME) plays a pivotal role in establishing malignancy and it is associated with high glycolytic metabolism and increased lactate production, which accumulates in the TME through monocarboxylate transporters (MCT1- 4) modulating tissue metabolic activity through proton-coupled transport of monocarboxylates, specifically L-lactate, ketone bodies, and pyruvate. However, lactate can act as both a metabolite and a signal molecule through the activation of its GPR81 receptor, encoded by the HCAR1 gene. In the first part of the PhD project, we investigated the role of lactate in GBM progression and metabolic reprogramming both in vitro and in an in vivo model. The in vitro study was carried out in three human glioblastoma cell lines treated with lactate (20 mM) and 3,5- dihydroxybenzoic acid (150 μM), a well-established pharmacological lactate receptor agonist. Cell proliferation, migration, colony formation capacity, and the expression of genes involved in mitochondrial metabolism were evaluated. Lactate metabolism was assessed by the expression of its transporters MCT1 and MCT4, and GRP81. The results were validated in patient-derived GBM biopsies, by comparing MCT1 expression in high (H-) versus low (L-) proliferative index (PI) GBM samples. The in vivo study was carried out in a zebrafish model of GBM,and the energy phenotype was assessed by Seahorse XFp, gene expression was evaluated by NGS sequencing, qPCR analysis and immunofluorescence. Effects of 20 mM lactate exposure on proliferation of developing brain tumors was assessed by counting phospho-histone 3 positive cells. Our results show that lactate significantly increased cell proliferation, migration, and colony formation capacity of GBM cells, both in vitro and in vivo. We also found that cells respond to high levels of extracellular lactate increasing MCT1 transporter expression in all three cell lines. In a Zebrafish model of GBM, altered metabolism and increased expression of MCT1 and GPR81 generate high levels of extracellular lactate, which in turn supports increased proliferation of tumor cells. Interestingly, 3,5-DHBA stimulation was able to increase significantly MCT1 in all tested cell lines. Furthermore, our results showed that both lactate and 3,5-DHBA exposure induced a significant increase in the expression levels of tested genes, confirming that lactate is involved in the metabolic switch of GMB cell lines. Finally, immunohistochemistry analysis on GBM biopsies demonstrated that High-PI GBM showed a significant increase in MCT1 and Ki67 expression levels when compared to Low-PI GBM. Furthermore, lactic acidosis has been reported in various solid TME including GBM. In particular, in TME various signaling molecules, growth factors and metabolites have been identified in sustaining GBM immune escape and inducing resistance to chemotherapy. During the early phases of the disease, microglia infiltrate TME thus contributing to tumorigenesis. Among various growth factors, insulin-like growth factor binding protein 6 (IGFBP6), an inhibitor of IGF-II actions, has been reported to play an important role in survival and migration of tumor cells, but its effects on tumor and immune system interaction is still poorly understood. Thus, in the second part of the PhD project we studied the crosstalk between lactate and IGFBP6 in microglial cells and how such interaction modulates TME and GBM progression. We tested our hypothesis in three human glioblastoma cell lines (i.e. U87-MG, A172 and U251) and a human microglia cell line (HMC3) treated with lactate (20 mM) and/or with IGFBP6 (400 ng/mL). Cell proliferation, migration and colony formation capacity were evaluated respectively by Xcelligence technology, clonogenic and wound healing assay. We also evaluated the expression of IGFBP6 mRNA levels of GBM cells and microglia cells treated with lactate. To further confirm the possible existence of a lactate- IGFBP6 axis, we evaluated the effect of lactate, IGFBP6 and the conditioned medium of IGFBP6 pre-treated GBM cells on microglia by immunocytochemical analyzes and RT-PCR to assess a potential M2 anti-inflammatory phenotype shift. Our results showed that microglia exposed to lactate significantly increased mRNA and protein expression of MCT1, and genes involved in mitochondrial metabolism. We also showed an increase in the M2 marker, Arg-1, and a reduction of iNOS suggestive of an M1-proinflammatory state. Furthermore, lactate treatment in microglia cells, induced a significant increase in IGFBP6 expression. Consistently, IGFBP6 treated GBM cells showed a significant increase in cell proliferation, migration, and colony formation capacity. Interestingly, our data showed that IGFBP6 treatment also resulted in an increase in marker M2, Arg-1, and a reduction of iNOS expression levels. These results were further confirmed by evaluating the expression of mRNA levels of M1 and M2 markers on microglia cells cultured with conditioned media from IGFBP6 pre-treated GBM cells. Finally, our results were further confirmed in patient-derived GBM biopsies and by transcriptome analysis. In conclusions, our results suggest that lactate and its transporter (MCT1) and receptor (GPR81) play a major role in GBM proliferation and migration, and it may represent a potential target to develop new strategies to counteract tumor progression and recurrencies and that there is a crosstalk lactate/IGFBP6 in microglial cells and that this relationship modulate TME impacting on tumor progression and resistance to therapy.

Il glioblastoma multiforme (GBM) è il tumore cerebrale primitivo più comune e più maligno del sistema nervoso centrale (SNC) negli adulti. Rappresenta la metà dei gliomi di nuova diagnosi e, nonostante il regime terapeutico aggressivo, la sopravvivenza mediana del paziente è di circa 14-17 mesi dopo la diagnosi. Il microambiente tumorale (TME) svolge un ruolo fondamentale nello stabilire la malignità ed è associato ad un elevato metabolismo glicolitico e ad una maggiore produzione di lattato, che si accumula nella TME attraverso trasportatori di monocarbossilati (MCT1-4) che modulano l'attività metabolica dei tessuti attraverso il trasporto accoppiato a protoni di monocarbossilati, in particolare L-lattato, corpi chetonici e piruvato. Tuttavia, il lattato può agire sia come metabolita che come molecola segnale attraverso l'attivazione del suo recettore GPR81, codificato dal gene HCAR1. Nella prima parte del progetto di dottorato, abbiamo studiato il ruolo del lattato nella progressione del GBM e nella riprogrammazione metabolica sia in vitro che in un modello in vivo. Lo studio in vitro è stato condotto su tre linee cellulari di glioblastoma umano trattate con lattato (20 mM) e acido 3,5-diidrossibenzoico (150 μM), un noto agonista farmacologico del recettore del lattato. Sono state valutate la proliferazione cellulare, la migrazione, la capacità di formazione di colonie e l'espressione di geni coinvolti nel metabolismo mitocondriale. Il metabolismo del lattato è stato valutato dall'espressione dei suoi trasportatori MCT1 e MCT4 e GRP81. I risultati sono stati convalidati in biopsie di GBM derivate dal paziente, confrontando l'espressione di MCT1 in campioni di GBM ad alto (H-) contro basso (L-) indice proliferativo (PI). Lo studio in vivo è stato condotto in un modello zebrafish di GBM e il fenotipo energetico è stato valutato mediante Seahorse XFp, l'espressione genica è stata valutata mediante sequenziamento NGS, analisi qPCR e immunofluorescenza. Gli effetti dell'esposizione al lattato di 20 mM sulla proliferazione dei tumori cerebrali in via di sviluppo sono stati valutati contando le cellule positive al fosfo-istone 3. I nostri risultati mostrano che il lattato ha aumentato significativamente la proliferazione cellulare, la migrazione e la capacità di formazione di colonie delle cellule GBM, sia in vitro che in vivo. Abbiamo anche scoperto che le cellule rispondono ad alti livelli di lattato extracellulare aumentando l'espressione del trasportatore MCT1 in tutte e tre le linee cellulari. In un modello Zebrafish di GBM, metabolismo alterato e maggiore espressione di MCT1 e GPR81 generano alti livelli di lattato extracellulare, che a sua volta supporta una maggiore proliferazione delle cellule tumorali. È interessante notare che la stimolazione con 3,5-DHBA è stata in grado di aumentare significativamente l'MCT1 in tutte le linee cellulari testate. Inoltre, i nostri risultati hanno mostrato che l'esposizione sia al lattato che al 3,5-DHBA ha indotto un aumento significativo dei livelli di espressione dei geni testati, confermando che il lattato è coinvolto nell'interruttore metabolico delle linee cellulari GMB. Infine, l'analisi immunoistochimica su biopsie GBM ha dimostrato che GBM ad alto PI ha mostrato un aumento significativo dei livelli di espressione di MCT1 e Ki67 rispetto a GBM a basso PI. Inoltre, è stata segnalata acidosi lattica in vari TME solidi incluso GBM. In particolare, nella TME sono state identificate diverse molecole segnale, fattori di crescita e metaboliti che sostengono la fuga immunitaria da GBM e inducono resistenza alla chemioterapia. Durante le prime fasi della malattia, le microglia si infiltrano nella TME contribuendo così alla tumorigenesi. Tra i vari fattori di crescita, è stato riportato che la proteina 6 legante il fattore di crescita insulino-simile (IGFBP6), un inibitore delle azioni dell'IGF-II, svolge un ruolo importante nella sopravvivenza e nella migrazione delle cellule tumorali, ma i suoi effetti sull'interazione tra tumore e sistema immunitario è ancora poco compreso. Pertanto, nella seconda parte del progetto di dottorato abbiamo studiato il crosstalk tra lattato e IGFBP6 nelle cellule microgliali e come tale interazione modula la progressione di TME e GBM. Abbiamo testato la nostra ipotesi in tre linee cellulari di glioblastoma umano (cioè U87-MG, A172 e U251) e una linea cellulare di microglia umana (HMC3) trattata con lattato (20 mM) e/o con IGFBP6 (400 ng/mL). La proliferazione cellulare, la migrazione e la capacità di formazione di colonie sono state valutate rispettivamente mediante la tecnologia Xcelligence, il test clonogenico e la guarigione delle ferite. Abbiamo anche valutato l'espressione dei livelli di mRNA di IGFBP6 delle cellule GBM e delle cellule della microglia trattate con lattato. Per confermare ulteriormente la possibile esistenza di un asse lattato-IGFBP6, abbiamo valutato l'effetto del lattato, dell'IGFBP6 e del mezzo condizionato delle cellule GBM pretrattate con IGFBP6 sulla microglia mediante analisi immunocitochimiche e RT-PCR per valutare un potenziale fenotipo antinfiammatorio M2 cambio. I nostri risultati hanno mostrato che la microglia esposta al lattato aumentava significativamente l'espressione dell'mRNA e delle proteine ​​di MCT1 e dei geni coinvolti nel metabolismo mitocondriale. Abbiamo anche mostrato un aumento del marker M2, Arg-1, e una riduzione di iNOS indicativa di uno stato proinfiammatorio M1. Inoltre, il trattamento con lattato nelle cellule della microglia ha indotto un aumento significativo dell'espressione di IGFBP6. Coerentemente, le cellule GBM trattate con IGFBP6 hanno mostrato un aumento significativo della proliferazione cellulare, della migrazione e della formazione di colonie. È interessante notare che i nostri dati hanno mostrato che il trattamento con IGFBP6 ha comportato anche un aumento del marker M2, Arg-1 e una riduzione dei livelli di espressione di iNOS. Questi risultati sono stati ulteriormente confermati valutando l'espressione dei livelli di mRNA dei marcatori M1 e M2 su cellule di microglia coltivate con terreni condizionati da cellule GBM pretrattate con IGFBP6. Infine, i nostri risultati sono stati ulteriormente confermati dalle biopsie GBM derivate dal paziente e dall'analisi del trascrittoma. In conclusione, i nostri risultati suggeriscono che il lattato e il suo trasportatore (MCT1) e recettore (GPR81) svolgono un ruolo importante nella proliferazione e migrazione del GBM e possono rappresentare un potenziale bersaglio per sviluppare nuove strategie per contrastare la progressione e le recidive del tumore e che non vi è un crosstalk lattato/IGFBP6 nelle cellule microgliali e che questa relazione modula la TME influenzando la progressione del tumore e la resistenza alla terapia.