Il melanoma cutaneo rappresenta il cancro della pelle più aggressivo a causa della sua alta invasività e del suo alto potere metastatico. Nonostante l'adozione di nuovi programmi di screening e lo sviluppo di nuovi trattamenti farmacologici, i tassi di incidenza e mortalità del melanoma cutaneo sono in costante aumento, evidenziando la necessità di nuovi biomarcatori diagnostici e prognostici, nonché di nuovi bersagli terapeutici per la gestione di questa patologia. Recentemente, diversi studi hanno dimostrato che lo sviluppo del melanoma cutaneo non è solo provocato da mutazioni genetiche che colpiscono oncogeni chiave, ma è anche associato a diverse modificazioni epigenetiche responsabili delle alterazioni di diversi processi cellulari e molecolari alla base della trasformazione neoplastica dei melanociti. Tra le alterazioni epigenetiche, la metilazione del DNA rappresenta la modificazione non strutturale del DNA principalmente coinvolta nell'alterazione dei livelli di espressione di geni potenzialmente responsabili della perdita dei processi apoptotici e della proliferazione cellulare incontrollata coinvolti nell'insorgenza e nella progressione dei tumori. È stato inoltre ipotizzato che la metilazione del DNA possa rappresentare un evento precoce di trasformazione neoplastica e che l'identificazione degli hotspot di metilazione del DNA possa essere utilizzata come strategia promettente per la diagnosi precoce del melanoma cutaneo. Su queste basi, lo scopo del presente studio è stato quello di valutare lo stato complessivo della metilazione del DNA nel melanoma cutaneo al fine di identificare gli hotspot di metilazione del DNA coinvolti nello sviluppo e nella progressione di questo tumore. Particolare attenzione è stata rivolta allo studio dei fenomeni di metilazione del DNA che interessano i geni coinvolti nel differenziamento dei melanociti e nella transizione da epiteliale a mesenchimale. A tal fine, è stata prima eseguita un'analisi bioinformatica utilizzando il software R EpiMethEx per valutare la correlazione tra la metilazione del DNA e i dati di espressione genica contenuti nei database The Cancer Genome Atlas (TCGA) e GTEx, identificando così i geni il cui stato di metilazione era correlato positivamente o negativamente con espressione genica. Successivamente, sono state eseguite analisi di Gene Ontology per stabilire il ruolo funzionale di questi geni e identificare un sottogruppo di fattori di trascrizione coinvolti nello sviluppo embrionale e nella formazione della cresta neurale, nonché nel differenziamento melanocitario potenzialmente coinvolto nello sviluppo del melanoma. Attraverso queste analisi computazionali, è stato possibile identificare un insieme di hotspot di metilazione del DNA che interessano geni disregolati coinvolti nello sviluppo e nella progressione del melanoma cutaneo. Tra questi geni, sono stati selezionati gli hotspot di metilazione del DNA che interessano RARB e ISL1 per le analisi di validazione eseguite su linee cellulari di melanoma e campioni di melanoma FFPE. In particolare, i livelli di espressione e metilazione di questi due fattori di trascrizione sono stati valutati in cinque linee cellulari di melanoma, A375, A2058, M14, MeWo e SK-23-MEL. I livelli di espressione sia di RARB che di ISL1 sono stati valutati mediante droplet digital PCR (ddPCR) mentre i livelli di metilazione degli hotspot di metilazione del DNA identificati computazionalmente sono stati valutati utilizzando un protocollo personalizzato sviluppato dal Laboratorio di Oncologia Sperimentale dell'Università di Catania definito Methylation Sensitive Restrizione PCR digitale con goccioline di enzimi (MSRE-ddPCR). I risultati in vitro sono stati ulteriormente convalidati in una coorte pilota di pazienti con melanoma attraverso l'analisi dei livelli di metilazione degli hotspot di metilazione del DNA di RARB e ISL1 rilevati nei tessuti del melanoma FFPE e nei controlli normali. Le valutazioni in vitro e cliniche dei livelli di metilazione di RARB e ISL1 hanno confermato i risultati bioinformatici ottenuti tramite EpiMethEx dimostrando una correlazione negativa tra metilazione del promotore di RARB ed espressione genica e una correlazione positiva tra metilazione intragenica di ISL1 ed espressione genica. Pertanto, i dati computazionali e i dati sperimentali ottenuti in questo studio dimostrano l'alto valore predittivo delle analisi eseguite con lo strumento EpiMethEx, nonché la riproducibilità dei risultati ottenuti dal protocollo di analisi della metilazione MSRE-ddPCR qui sviluppato. Nel complesso, i risultati di questo studio aprono la strada allo sviluppo di nuove strategie per l'identificazione di biomarcatori diagnostici e prognostici del melanoma. I risultati finora ottenuti devono essere validati clinicamente in una serie di pazienti con melanoma cutaneo, individui sani e individui a rischio per questa patologia.
Cutaneous melanoma represents the most aggressive skin cancer due to its high invasive and metastatic behavior. Despite the adoption of novel screening programs and the development of new pharmacological treatments, the incidence and mortality rates of cutaneous melanoma are constantly increasing highlighting the need for novel diagnostic and prognostic biomarkers as well as new therapeutic targets for the management of this pathology. Recently, several studies have demonstrated that the development of cutaneous melanoma is not only prompted by gene mutations affecting key oncogenes but is also associated with several epigenetic modifications responsible for the alterations of different cellular and molecular processes underlying the neoplastic transformation of melanocytes. Among the epigenetic alterations, DNA methylation represents the non-structural modification of DNA mainly involved in the alteration of the expression levels of genes potentially responsible for the loss of apoptotic processes and uncontrolled cell proliferation responsible for the onset and progression of tumors. It was also hypothesized that DNA methylation could represent an early event of neoplastic transformation and that the identification of DNA methylation hotspots could be used as a promising strategy for the early diagnosis of cutaneous melanoma. On these bases, the aim of the present study was to evaluate the overall DNA methylation status in cutaneous melanoma in order to identify DNA methylation hotspots involved in the development and progression of this tumor. Particular attention was paid to the study of DNA methylation phenomena affecting genes involved in melanocyte differentiation and epithelial to mesenchymal transition. For these purposes, a bioinformatics analysis was first performed using the EpiMethEx R-package to evaluate the correlation between DNA methylation and gene expression data contained in The Cancer Genome Atlas (TCGA) and GTEx databases thus identifying genes whose methylation status correlated positively or negatively with gene expression. Subsequently, Gene Ontology analyses were performed to establish the functional role of these genes and to identify a subgroup of transcription factors involved in embryonic development and neural crest formation as well as in the melanocytic differentiation potentially involved in the development of melanoma. Through these computational analyses, it was possible to identify a set of DNA methylation hotspots affecting dysregulated genes involved in the development and progression of cutaneous melanoma. Among these genes, DNA methylation hotspots affecting RARB and ISL1 were selected for the validation analyses performed on melanoma cell lines and melanoma FFPE samples. In particular, the expression and methylation levels of these two transcription factors were evaluated in five melanoma cell lines, A375, A2058, M14, MeWo and SK-23-MEL. The expression levels of both RARB and ISL1 were evaluated by using droplet digital PCR (ddPCR) while the methylation levels of the DNA methylation hotspots computationally identified were assessed using a custom protocol developed by the Laboratory of Experimental Oncology of the University of Catania defined Methylation Sensitive Restriction Enzyme droplet digital PCR (MSRE-ddPCR). The in vitro findings were further validated in a pilot cohort of melanoma patients through the analysis of the methylation levels of the DNA methylation hotspots of RARB and ISL1 detected in FFPE melanoma tissues and normal controls. The in vitro and clinical evaluations of RARB and ISL1 methylation levels confirmed the bioinformatic results obtained through EpiMethEx demonstrating a negative correlation between RARB promoter methylation and gene expression and a positive correlation between ISL1 intragenic methylation and gene expression. Therefore, the bioinformatics and experimental data obtained in this study demonstrate the high predictive value of the analyzes performed with the EpiMethEx tool as well as the reproducibility of the results obtained by the highly sensitive MSRE-ddPCR methylation analysis protocol here developed. Overall, the findings of this study pave the way for the development of novel strategies for the identification of diagnostic and prognostic melanoma biomarkers. The results obtained so far need to be clinically validated in a series of patients with cutaneous melanoma, healthy individuals and individuals at risk for this pathology.
Identificazione e Validazione di Hotspot di Metilazione del DNA come Biomarcatori per il Melanoma Cutaneo / Falzone, Luca. - (2021 Nov 25).
Identificazione e Validazione di Hotspot di Metilazione del DNA come Biomarcatori per il Melanoma Cutaneo
FALZONE, LUCA
2021-11-25
Abstract
Il melanoma cutaneo rappresenta il cancro della pelle più aggressivo a causa della sua alta invasività e del suo alto potere metastatico. Nonostante l'adozione di nuovi programmi di screening e lo sviluppo di nuovi trattamenti farmacologici, i tassi di incidenza e mortalità del melanoma cutaneo sono in costante aumento, evidenziando la necessità di nuovi biomarcatori diagnostici e prognostici, nonché di nuovi bersagli terapeutici per la gestione di questa patologia. Recentemente, diversi studi hanno dimostrato che lo sviluppo del melanoma cutaneo non è solo provocato da mutazioni genetiche che colpiscono oncogeni chiave, ma è anche associato a diverse modificazioni epigenetiche responsabili delle alterazioni di diversi processi cellulari e molecolari alla base della trasformazione neoplastica dei melanociti. Tra le alterazioni epigenetiche, la metilazione del DNA rappresenta la modificazione non strutturale del DNA principalmente coinvolta nell'alterazione dei livelli di espressione di geni potenzialmente responsabili della perdita dei processi apoptotici e della proliferazione cellulare incontrollata coinvolti nell'insorgenza e nella progressione dei tumori. È stato inoltre ipotizzato che la metilazione del DNA possa rappresentare un evento precoce di trasformazione neoplastica e che l'identificazione degli hotspot di metilazione del DNA possa essere utilizzata come strategia promettente per la diagnosi precoce del melanoma cutaneo. Su queste basi, lo scopo del presente studio è stato quello di valutare lo stato complessivo della metilazione del DNA nel melanoma cutaneo al fine di identificare gli hotspot di metilazione del DNA coinvolti nello sviluppo e nella progressione di questo tumore. Particolare attenzione è stata rivolta allo studio dei fenomeni di metilazione del DNA che interessano i geni coinvolti nel differenziamento dei melanociti e nella transizione da epiteliale a mesenchimale. A tal fine, è stata prima eseguita un'analisi bioinformatica utilizzando il software R EpiMethEx per valutare la correlazione tra la metilazione del DNA e i dati di espressione genica contenuti nei database The Cancer Genome Atlas (TCGA) e GTEx, identificando così i geni il cui stato di metilazione era correlato positivamente o negativamente con espressione genica. Successivamente, sono state eseguite analisi di Gene Ontology per stabilire il ruolo funzionale di questi geni e identificare un sottogruppo di fattori di trascrizione coinvolti nello sviluppo embrionale e nella formazione della cresta neurale, nonché nel differenziamento melanocitario potenzialmente coinvolto nello sviluppo del melanoma. Attraverso queste analisi computazionali, è stato possibile identificare un insieme di hotspot di metilazione del DNA che interessano geni disregolati coinvolti nello sviluppo e nella progressione del melanoma cutaneo. Tra questi geni, sono stati selezionati gli hotspot di metilazione del DNA che interessano RARB e ISL1 per le analisi di validazione eseguite su linee cellulari di melanoma e campioni di melanoma FFPE. In particolare, i livelli di espressione e metilazione di questi due fattori di trascrizione sono stati valutati in cinque linee cellulari di melanoma, A375, A2058, M14, MeWo e SK-23-MEL. I livelli di espressione sia di RARB che di ISL1 sono stati valutati mediante droplet digital PCR (ddPCR) mentre i livelli di metilazione degli hotspot di metilazione del DNA identificati computazionalmente sono stati valutati utilizzando un protocollo personalizzato sviluppato dal Laboratorio di Oncologia Sperimentale dell'Università di Catania definito Methylation Sensitive Restrizione PCR digitale con goccioline di enzimi (MSRE-ddPCR). I risultati in vitro sono stati ulteriormente convalidati in una coorte pilota di pazienti con melanoma attraverso l'analisi dei livelli di metilazione degli hotspot di metilazione del DNA di RARB e ISL1 rilevati nei tessuti del melanoma FFPE e nei controlli normali. Le valutazioni in vitro e cliniche dei livelli di metilazione di RARB e ISL1 hanno confermato i risultati bioinformatici ottenuti tramite EpiMethEx dimostrando una correlazione negativa tra metilazione del promotore di RARB ed espressione genica e una correlazione positiva tra metilazione intragenica di ISL1 ed espressione genica. Pertanto, i dati computazionali e i dati sperimentali ottenuti in questo studio dimostrano l'alto valore predittivo delle analisi eseguite con lo strumento EpiMethEx, nonché la riproducibilità dei risultati ottenuti dal protocollo di analisi della metilazione MSRE-ddPCR qui sviluppato. Nel complesso, i risultati di questo studio aprono la strada allo sviluppo di nuove strategie per l'identificazione di biomarcatori diagnostici e prognostici del melanoma. I risultati finora ottenuti devono essere validati clinicamente in una serie di pazienti con melanoma cutaneo, individui sani e individui a rischio per questa patologia.File | Dimensione | Formato | |
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