IDENTIFICAZIONE COMPUTAZIONALE DELLE ALTERAZIONI EPIGENETICHE E RUOLO DEL MICROAMBIENTE TUMORALE E DEL MICROBIOTA ORALE NELLO SVILUPPO DEL CARCINOMA ORALE A CELLULE SQUAMOSE

The incidence of oral cavity cancer is widely increasing in the last years, mainly in Southeast Asian countries due to extensive use of tobacco and alcohol. Nevertheless, the incidence of this cancer seems to be enhanced also in young adults (age <40 years) in many Western countries. Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the most common malignant tumor of the oral cavity, representing more than 90% of all oral malignancies. Although oral cavity is easily accessible to clinical examination, most of oral tumors are still diagnosed in an advanced stage (III and IV) and thus are associated with a high rate of mortality. Moreover, no reliable biomarkers are currently available for an early oral cancer detection. Thus, the identification of novel and effective biomarkers able to enhance both diagnostic and prognostic protocols in oral cancer is strongly necessary. Recent decades have been characterized by great progress in understanding of the etiology, biology, and molecular basis of oral cancer and specifically, how the specific tumor microenvironment is able to interfere with cancer initiation and progression. Chronic inflammatory conditions, unbalanced signaling networks, alterations in microbiota composition, and epigenetic modifications contribute to establish a specific tumor microenvironment closely related to cancer initiation. Recently, microbiota alterations have aroused great interest due to their association with the development of human tumors, including oral cancer. Some specific bacterial strains such as Capnocytophaga gingivalis,Fusobacterium spp., and Streptococcus spp. have been identified and considered to be able to contribute to carcinogenesis when deregulated.Furthermore, the modified expression of specific genes and the consequent de-regulation of their signaling pathways has been clearly linked with carcinogenic degeneration. Interestingly, epigenetic modifications may assume a pivotal role in this scenario. The term “epigenetics” refers to heritable changes in gene expression that do not elicit modifications in the DNA sequence. Thus, DNA methylation, acetylation, histone modifications, chromatin remodeling, and noncoding RNA including microRNAs (miRs) mechanisms for gene silencing are implicated in oral cancer progression. miRs are small noncoding RNA, long 18/25 nucleotides which can affect gene expression, modifying the biological processes such as proliferation, apoptosis, and cell differentiation. Of note, they have been proposed as biomarkers of different stages of cancer, from early detection to prognosis. Aim of this dissertation is to summarize the current evidence on oral cancer pathophysiology, and propose novel biomarkers in cancer diagnosis and prognosis. More in detail, in the Chapter 1, I present a general overview on oral cancer epidemiology, clinics and treatment, with a particular emphasis on recognized factor risks including tobacco, alcohol consumption, viral infections, preexisting oral lesions, and oral microbiota modifications. In regard to the oral dysbiosis, it is widely treated in the Chapter 2, focusing on mechanisms such as chronic inflammation, by which oral microbiota alterations could promote carcinogenesis. Then, the Chapter 3 is devoted to the molecular pathways involved in oral cancer initiation, mainly to the role of miRs in cancer transformation and progression. Finally, the Chapter 4 extensively deals with the experimental contribute performed to identify miRs with diagnostic and prognostic function in the OSCC. For this objective, GEO DataSets and TCGA Head and Neck Cancer (HNSC) databases have been analyzed. Moreover,different computational approaches were used to detect the functional roles of these miRs. The analysis conducted has permitted to identify 11 miRs differentially expressed in tumor/normal samples and 8 linked with a different cancer stage progression. The set of miRs identified, after in vitro and in vivo validation, could represent a suitable tool for an early cancer detection and better understanding of its prognosis, supporting the clinicians in the best therapeutic choice.

L'incidenza del carcinoma orale è notevolmente aumentata negli ultimi anni, soprattutto nei paesi del sud-est asiatico, a causa dell’abuso di tabacco e alcool. Tuttavia, l'incidenza di questo cancro sembra essere in incremento anche nei paesi occidentali, nella fascia di popolazione più giovane (età <40 anni). Il carcinoma orale a cellule squamose (OSCC) è il tumore maligno più comune della cavità orale e rappresenta più del 90% di tutti i tumori maligni della bocca. Sebbene il cavo orale sia facilmente accessibile all'esame clinico, la maggior parte dei tumori orali sono ancora diagnosticati in uno stadio avanzato (III e IV) e sono quindi associati ad un alto tasso di mortalità. Inoltre, non sono attualmente disponibili dei biomarkers affidabili per una diagnosi precoce. Pertanto, l'identificazione di nuovi ed efficaci marcatori in grado di migliorare i protocolli diagnostici e prognostici è strettamente necessaria. Gli ultimi decenni sono stati caratterizzati da notevoli progressi nella comprensione dell'eziologia, della biologia e delle basi molecolari del cancro orale e, in particolare, di come lo specifico microambiente tumorale sia in grado di interferire con l'inizio e la progressione del cancro. Condizioni infiammatorie croniche, alterazioni nei sistemi di trasmissione cellulare, variazioni nella composizione del microbiota e modifiche epigenetiche contribuiscono a determinare uno specifico microambiente propizio alla progressione tumorale. Recentemente, le alterazioni del microbiota hanno suscitato particolare interesse a causa della loro associazione con lo sviluppo di alcuni tumori umani, compreso il cancro orale. Alcuni ceppi batterici come Capnocytophaga gingivalis, Fusobacterium spp., e Streptococcus spp. sono stati correlati alla carcinogenesi quando alterati. Inoltre, l'espressione mutata di specifici geni e la conseguente de-regolazione delle loro vie di segnalazione è stata chiaramente collegata alla degenerazione cellulare maligna. È interessante notare che le variazioni epigenetiche possono assumere un ruolo centrale in questo scenario. Il termine "epigenetica" si riferisce a cambiamenti ereditabili nell'espressione genica che non provocano modifiche nella sequenza del DNA. Così, la metilazione del DNA, l'acetilazione, le modifiche degli istoni, il rimodellamento della cromatina e i meccanismi di RNA non codificanti, compresi i microRNA (miR), coinvolti nel silenziamento genico, risultano implicati nella progressione del carcinoma orale. Nello specifico, i miRs sono piccoli RNA non codificanti, lunghi 18/25 nucleotidi che possono influenzare l'espressione genica, modificando i processi biologici come la proliferazione, l'apoptosi e la differenziazione cellulare. Sono stati proposti come biomarcatori di diagnosi tumorale precoce ed indici di prognosi della malattia. Lo scopo di questa tesi è sintetizzare le conoscenze attuali sulla fisiopatologia della carcinogenesi orale, ed identificare nuovi potenziali biomarcatori utili nella diagnosi e prognosi dell’OSCC. Più in dettaglio, nel Capitolo 1, è presentata una panoramica sull'epidemiologia, la clinica e il trattamento del carcinoma orale, con particolare enfasi sui fattori di rischio riconosciuti tra cui il tabacco, il consumo di alcool, le infezioni virali, le lesioni orali preesistenti e le modifiche del microbiota orale. Per quanto riguarda la disbiosi orale, essa sarà ampiamente trattata nel Capitolo 2, con riferimento a come il connubio tra infiammazione cronica e alterazioni del microbiota orale possa promuovere la carcinogenesi. Il Capitolo 3 è dedicato ai meccanismi molecolari coinvolti nella progressione tumorale, principalmente al ruolo svolto dai miRs. Infine, il Capitolo 4 illustra il contributo sperimentale il cui obiettivo è stato quello di identificare potenziali miRs con funzione diagnostica e prognostica nel carcinoma orale. A tale scopo, sono stati analizzati i database GEO DataSets e TCGA Head and Neck Cancer (HNSC). Inoltre, sono stati utilizzati diversi approcci computazionali per individuare i ruoli funzionali dei miRs selezionati. In breve, l'analisi condotta ha permesso di individuare 11 miRs espressi differentemente nei campioni sani e tumorali e 8 miRs legati a una diversa stadiazione tumorale. I miRs identificati, dopo la validazione in vitro e in vivo, potrebbero rappresentare un utile strumento sia diagnostico che prognostico, supportando gli specialisti nel percorso terapeutico.