Identificazione di nuovi biomarcatori epigenetici per la diagnosi precoce del carcinoma colorettale

Colorectal cancer (CRC) is one of the leading causes of cancer death worldwide. Currently, no effective early diagnostic biomarkers are available for colorectal carcinoma. Therefore, there is a need to discover new potential biomarkers for the early diagnosis of this tumor or pre-cancerous lesions. Several studies have demonstrated the diagnostic potential of microRNAs, a class of small non-coding RNA of 20-22 nucleotides in length, whose dysregulation has been already associated with the development of different pathologies. On these bases, the aim of the present study was to computationally identify a set of miRNAs associated with the development and progression of colorectal cancer in order to validate their diagnostic and prognostic potential in a pilot cohort of CRC patients and healthy controls. In particular, first a bioinformatics analysis was performed by analyzing the computational data contained in The Cancer Genome Atlas (TCGA) and GEO DataSets databases in order to identify a list of miRNAs associated with the development of colorectal cancer. Further bioinformatics prediction tools were used to establish the functional role of these miRNAs in colorectal cancer. Subsequently, the in silico data were validated in both FFPE and liquid biopsy samples obtained from colorectal cancer patients and healthy controls by using the high-sensitive droplet digital PCR (ddPCR) amplification systems. After ddPCR analyses, the diagnostic potential of four selected miRNAs, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-503-5p and hsa-miR-375 was assessed through statistical analyses and further bioinformatics evaluations. The bioinformatics analyses allowed to identify a set of 19 miRNAs significantly dysregulated in colorectal cancer patients and thus potentially useful as diagnostic biomarkers for this pathology. Further computational approaches allowed us to select the four miRNAs hsa-miR-21-5p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-503-5p and hsa-miR-375 in order to validate their diagnostic and prognostic potential on FFPE and liquid biopsy samples. The ddPCR analyses revealed that the expression levels of hsa-miR-21-5p and hsa-miR-503-5p were significantly increased in colorectal cancer FFPE samples compared to the normal adjacent mucosa while the expression levels of hsa-miR-375 and hsa-miR-497-5p were significantly down-regulated in tumor tissues. Weaker results were obtained for the liquid biopsy samples where only hsa-miR-21-5p expression levels increased significantly in tumor samples and only hsa-miR-497-5p showed a significant decrement of the circulating levels in tumor patients. After validating the diagnostic potential of the miRNAs here identified, the results of further computational analyses allowed us to establish also the prognostic value of the selected miRNAs. In particular, the circulating levels of hsa-miR-375 can be used as a reliable prognostic biomarker to establish the overall survival of patients. Similarly, the tissue levels of hsa-miR-21-5p, hsa-miR-503-5p and hsa-miR-375 can predict the overall survival rate of patients at the diagnosis. Overall, the results obtained confirmed the bioinformatics results previously observed. Therefore, this study represents the starting point for the adoption of ddPCR for the effective and sensitive analysis of miRNA expression levels both in tissue and liquid biopsy samples. Thus, this strategy could be applied for the non-invasive early diagnosis of colorectal cancer for individuals at risk for this tumor.

Il cancro del colon-retto (CRC) è una delle principali cause di morte per cancro in tutto il mondo. Attualmente, non sono disponibili biomarcatori diagnostici precoci efficaci per il carcinoma del colon-retto. Pertanto, è necessario scoprire nuovi potenziali biomarcatori per la diagnosi precoce di questo tumore o delle lesioni precancerose. Diversi studi hanno dimostrato il potenziale diagnostico dei microRNA, una classe di piccoli RNA non codificanti di 20-22 nucleotidi di lunghezza, la cui disregolazione è stata già associata allo sviluppo di diverse patologie. Su queste basi, lo scopo del presente studio è stato quello di identificare computazionalmente un insieme di miRNA associati allo sviluppo e alla progressione del cancro del colon-retto al fine di convalidare il loro potenziale diagnostico e prognostico in una coorte pilota di pazienti con CRC e controlli sani. In particolare, è stata eseguita prima un'analisi bioinformatica analizzando i dati computazionali contenuti nei database The Cancer Genome Atlas (TCGA) e GEO DataSets al fine di identificare un elenco di miRNA associati allo sviluppo del cancro del colon-retto. Ulteriori strumenti di previsione bioinformatici sono stati utilizzati per stabilire il ruolo funzionale di questi miRNA nel cancro del colon-retto. Successivamente, i dati in silico sono stati convalidati sia in campioni inclusi in paraffina sia in campioni di biopsia liquida ottenuti da pazienti con cancro del colon-retto e controlli sani utilizzando i sistemi di amplificazione ad alta sensibilità della droplet digital PCR (ddPCR). Dopo le analisi ddPCR, il potenziale diagnostico di quattro miRNA selezionati, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-503-5p e hsa-miR-375 è stato valutato attraverso analisi statistiche e ulteriori valutazioni bioinformatiche . Le analisi bioinformatiche hanno permesso di identificare un insieme di 19 miRNA significativamente disregolati nei pazienti con cancro del colon-retto e quindi potenzialmente utili come biomarcatori diagnostici per questa patologia. Ulteriori approcci computazionali ci hanno permesso di selezionare i quattro miRNA hsa-miR-21-5p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-503-5p e hsa-miR-375 al fine di validare il loro potenziale diagnostico e prognostico su FFPE e campioni di biopsia liquida. Le analisi ddPCR hanno rivelato che i livelli di espressione di hsa-miR-21-5p e hsa-miR-503-5p erano significativamente aumentati nei campioni FFPE di cancro del colon-retto rispetto alla normale mucosa adiacente mentre i livelli di espressione di hsa-miR-375 e hsa -miR-497-5p erano significativamente down-regolati nei tessuti tumorali. Risultati più deboli sono stati ottenuti per i campioni di biopsia liquida in cui solo i livelli di espressione di hsa-miR-21-5p erano aumentati significativamente nei campioni di tumore mentre solo il miRNA hsa-miR-497-5p ha mostrato un decremento significativo dei livelli circolanti nei pazienti con tumore. Dopo aver validato il potenziale diagnostico dei miRNA qui identificati, i risultati di ulteriori analisi computazionali hanno permesso di stabilire anche il valore prognostico dei miRNA selezionati. In particolare, i livelli circolanti di hsa-miR-375 possono essere utilizzati come biomarcatore prognostico affidabile per stabilire la sopravvivenza globale dei pazienti. Allo stesso modo, i livelli tissutali di hsa-miR-21-5p, hsa-miR-503-5p e hsa-miR-375 possono predire il tasso di sopravvivenza globale dei pazienti al momento della diagnosi. Nel complesso, i risultati ottenuti hanno confermato i risultati bioinformatici precedentemente osservati. Pertanto, questo studio rappresenta il punto di partenza per l'adozione della ddPCR per l'analisi efficace e sensibile dei livelli di espressione di miRNA sia in campioni di biopsia tissutale che liquida. Pertanto, questa strategia potrebbe essere applicata per la diagnosi precoce non invasiva del cancro del colon-retto per gli individui a rischio di questo tumore.