Identificazione di LINC00483 come potenziale oncosoppressore nel carcinoma colorettale tramite un approccio combinato di biologia in silico ed in vitro.

Nell’ultimo decennio si è assistito ad un exploit di studi di sequenziamento su larga scala del genoma umano che hanno portato ad importanti e inaspettate scoperte: solo il 2% del genoma dei mammiferi codifica mRNA, mentre circa il 70% di questo è pervasivamente trascritto in lunghi e piccoli “non-coding RNA” (ncRNA). I “long non-coding RNA” (lncRNA) sono molecole di RNA non codificanti lunghe più di 200 bp, con o senza 5’-cap e coda di poly(A). L’esatta funzione dei lncRNA e i loro meccanismi di azione necessitano ancora di ricerche approfondite. Tuttavia, è stato dimostrato che i lncRNA svolgono un importante ruolo nella regolazione dell’espressione genica in varie malattie, incluso il cancro. Nel lavoro presentato in questa tesi abbiamo utilizzato un approccio combinato di biologia computazionale e sperimentale per identificare lncRNA la cui alterata espressione fosse associata alle caratteristiche clinico-patologiche più gravi del cancro colorettale (CRC). L’analisi di espressione su biopsie di CRC dei lncRNA precedentemente selezionati mediante l’analisi computazionale ci ha permesso di identificare un lncRNA – LINC00483 – che risultava sotto-espresso in maniera statisticamente significativa nei tessuti tumorali rispetto alla adiacente mucosa sana. Inoltre, questo lncRNA risultava anche down-regolato nei tumori metastatici rispetto ai primitivi, suggerendo un’associazione tra la sotto-espressione di LINC00483 e il fenotipo metastatico. La funzione di LINC00483 sembra essere associata all’inibizione della proliferazione e della transizione epitelio – mesenchima (EMT). La sua espressione, infatti, diminuiva nella linea cellulare di CRC HCT-116 trattata con TGFβ-1, noto induttore della EMT, mentre aumentava nelle cellule trattate con l’inibitore delle MAPK U0126, suggerendo così un’associazione tra la down-regolazione di LINC00483 e la trasformazione fenotipica da cellula epiteliale a mesenchimale, e tra l’up-regolazione di questo lncRNA ed il blocco del signalling iperproliferativo controllato da ERK. Per comprendere quale fosse il ruolo ed i target molecolari di LINC00483 abbiamo eseguito esperimenti di sovra-espressione in vitro tramite vettore d’espressione. Il saggio della migrazione e il saggio di proliferazione hanno mostrato che la sovra-espressione di LINC00483 riduceva la migrazione nelle HCT-116, tuttavia non è stato osservato un suo effetto fenotipico diretto sulla proliferazione cellulare. Ipotizzando una funzione di “miRNA sponge” per LINC00483 abbiamo identificato, tramite approccio computazionale, i potenziali mRNA target indiretti di LINC00483 (la cui espressione fosse positivamente correlata con il lncRNA e che fossero legati dagli stessi miRNA) e saggiato la loro espressione nelle HCT-116 trasfettate con il vettore. Tutti i geni target saggiati risultavano up-regolati nelle cellule trasfettate, confermando un’associazione tra LINC00483 e questi trascritti. Analizzando l’espressione di questi potenziali target su linee cellulari nelle quali era stata indotta la EMT ed il blocco del ciclo cellulare abbiamo messo in evidenza un particolare gene target - HIGD2A (HIG1 hypoxia inducible domain family member 2A) - la cui espressione era strettamente associata a quella di LINC00483. Inoltre, l’espressione di HIGD2A era ridotta nei tessuti di CRC rispetto alla adiacente mucosa sana e correlava positivamente e in maniera statisticamente significativa con quella di LINC00483. In conclusione, i nostri risultati suggeriscono che LINC00483 possa essere identificato come un nuovo gene oncosoppressore nel CRC e possa esplicare la sua funzione tramite il controllo negativo di processi legati alla EMT (i.e., migrazione cellulare) e della proliferazione cellulare. LINC00483 potrebbe operare attraverso una complessa network di interazione tra molecole di RNA nella quale si trova coinvolto il gene HIGD2A (così come anche altri dei geni target analizzati in questo studio), sebbene i meccanismi molecolari alla base della sua azione debbano essere chiariti ulteriormente.