Progettazione e studi preformulativi di formulazioni nanotecnologiche per la somministrazione intranasale di composti neuroattivi

Central nervous system (CNS) diseases (neurological, neurodegenerative and mood disorders) are rapidly increasing and affect a high proportion of the population worldwide. The etiology factors can be genetic or from the external environment, which perturb the homeostasis of the brain. In particular, this thesis project focuses on the treatment of diseases such as neuroinflammation and acute/chronic pain, schizophrenia, epilepsy and insomnia. Traditional drugs in their current pharmaceutical forms and administered via classical routes of administration have several limitations such as poor therapeutic adherence, low bioavailability at the target site (brain), side effects, high dosages and frequent administration. Moreover, the drugs used show poor solubility in aqueous solutions resulting in low permeation through biological membranes and bioavailability. Nanotechnology has provided multiple advantages: the delivery of poorly soluble drugs, bypassing membranes that are difficult to cross (such as the blood-brain barrier, BBB), targeted delivery to the target site resulting in increased drug bioavailability and reduced dosages, possibility of a prolonged drug release resulting in reduced frequency of administration, protection of the drug from the external environment (e.g., degradation enzymes), reduction of drug distribution in off-target sites, thus lowering its side effects. In addition, an innovative route of administration has been more recently investigated, namely the intranasal (IN) route, which is minimally invasive and easy for self-administration. To date, it is considered by the scientific community to be a valid alternative to the parenteral route as it allows for a high speed of action as the drug can either be picked up by the olfactory nerve and reach the brain directly, bypassing the BBB, or be quickly absorbed by the nasal mucosa, which is highly highly vascularised, to reach the brain. However, it presents many challenges to be overcome (muco-ciliary clearance, low administration volumes, potential irritation of the nasal mucosa). The aim of this thesis work has been the design, optimisation, preparation and characterisation of polymeric nanoparticles (NPs) for the IN delivery of neuroactive compounds, with brain as the target site. The polymers used were selected to ensure the sustained release of neuroactive compounds both at the level of the nasal mucosa (nose-blood-brain pathway) and at the level of the cerebrospinal fluid (nose-to-brain pathway, N2B), in order to improve the bioavailability of selected drugs: Diclofenac (DIC), Diclofenac epolamine (DIEP), clozapine (CZP) and carbamazepine (CBZ) in the brain. In a side study, food-grade polymeric microparticles (MPs), suitable for oral administration, were also developed and characterised for the delivery of natural neuroactive ingredients (NNIs), RL1 and RL2, useful in the treatment of insomnia*. The selected polymer, in addition to being 'Generally Recognised as Safe' (GRAS) and having received by EFSA the food-grade qualification, possesses gastro-resistant properties and can ensure a prolonged release of NNIs in the small intestine. Furthermore, the preparation technique used is easily scalable and can be applied in the nutraceutical industry. The paper I (Lombardo et al. – Pharmaceutical Development and Technology, 2021) is a review on the progress of nanotechnology for the delivery of active ingredients (AIs) through IN administration. This review focuses on IN delivery by describing the anatomy of the nose, the BBB and its functions, the carrier of drugs from the nose to the brain, and the advantages and disadvantages of IN delivery. Finally, it reports the advances in the last 10 years of nanotechnology related to IN delivery systems for active ingredients, such as: microspheres, mucoadhesive microparticles (MPs), microemulsions, polymeric nanoparticles (NPs), solid lipid NPs (SLN), nanostructured lipid carriers (NLC), inorganic NPs, virus-like and self-assembling protein NPs (VLNP), dendrimers, quantum dots, (QDs) nanogels, nanoemulsions (NEs), and liposomes. In paper II (Corsaro, Lombardo et al. – Applied Sciences, 2022) polymeric NPs were developed via the quasi-solvent evaporation emulsion (QESD) method for the IN administration of DIC and its epolamine salt (DIEP). The drugs were encapsulated in a mixture of two polymers, Eudragit® Retard RS100 and RL100, to ensure sustained release at the level of the nasal mucosa and drug absorption through the mucosa to reach the brain (nose-blood-brain pathway). The optimized NP batches were characterised to assess their thermotropic behaviour by differential scanning calorimetry (DSC). In addition, these polymers were selected for their cationic charge to improve the NPs mucoadhesive properties, which are ideal for residing longer in the nasal cavity and allowing for greater drug absorption through the nasal mucosa, their mucoadhesive properties were assessed. This study was performed in vitro by measuring the change in Zeta potential and by turbidimetric assay after incubation of NPs with mucin in simulated nasal fluid (SNF), compared to pure drug suspensions. The results showed that NPs exhibited strong interactions with mucin. The stability of DIC- and DIEP-loaded NPs was also assessed in SNF to predict potential aggregation phenomena after nasal administration. Finally, in vivo experiments demonstrated the absence of toxicity on the nasal mucosa of mice. In paper III (Lombardo et al. – Pharmaceutics, 2023) mucoadhesive polymeric NPs (1:1 mixture of Eudragit® Retard, RS100 and RL100) have been formulated for the IN delivery of clozapine (CZP). NPs showed a size of approximately 400-500 nm, which can reside in the nasal cavity, where the drug can be released in a sustained manner and absorbed through the nasal mucosa to reach the brain (nose-blood-brain pathway). NPs showed a controlled release of CZP for up to 8 hours. Furthermore, preliminary in vitro mucoadhesion studies showed that the NPs already exhibited strong electrostatic interactions with mucin at time zero, due to the presence of the positive charge of the copolymers used. To reduce mucociliary clearance, in addition to the mucoadhesive properties, the administration of NPs in powder form may be useful. This certainly also improves the storage stability of the formulation. Thus, the suspension was lyophilised using 5% (w/v) HP-β-CD as cryoprotectant. This ensured the preservation of the size, PDI and zeta potential (ZP) of the NPs. In addition, physic-ochemical characterisation studies of the NPs in the solid state were carried out. Finally, toxicity studies were performed in vitro on MDCKII cells and primary human olfactory mucosa cells and in vivo on the nasal mucosa of CD-1 mice. The latter showed non-toxicity of unloaded NPs and mild tissue abnormalities induced by CZP-loaded NPs. In paper IV (Bonaccorso et al. – Pharmaceutical Development and Technology, 2023) carbamazepine (CBZ) nanocrystals (NCs) were designed and optimised for immediate and direct N2B delivery. CBZ-NCs were prepared by solvent-antisolvent sonoprecipitation technique and the optimised formulation, through the Quality by Design approach, showed a mean size of 291.2 nm ± 34.71 with an almost narrow distribution (PDI ~ 0.4) and a neutral charge (ZP of -1.43 mV). The suspension was converted in a powder by freeze-drying process, under cryoprotection with 5% (w/v) mannitol. The characterization studies were conducted to evaluate the thermotropic behaviour, crystallinity, morphology and drug content. Preliminary in vitro mucoadhesion studies showed a slight interaction with mucin (13.3% in 1 h and 6.6% in 24 h). Furthermore, in vitro stability studies conducted in artificial cerebrospinal fluid (aCSF) showed no aggregation of NCs. Finally, CBZ-NCs showed no signs of toxicity in olfactory ensheating cells. In paper V (Lombardo et al., in progress) NPs with two different polymers, PLGA and PCL, were developed and optimised for the delivery of CZP via the N2B pathway. The NPs were formulated by the solvent deposition method and solid-state characterisation, in vitro and ex vivo studies were performed to compare the different chemical-physical and biological properties of PLGA-NPs and PCL-NPs. The resulting suspensions were converted into the final powder formulation, which were cryoprotected with 5% (w/v) D-maltose for PLGA-NPs and 25% (w/v) D-maltose for PCL-NPs. The NPs showed a size of about 200 nm, suitable for reuptake from the olfactory nerve to reach the brain directly, where they could release the drug. In vitro release studies conducted in aCSF and SNF gave the following results: PLGA-NPs released 100% of the drug in 4 days in SNF, while in aCSF they released about 80% in 20 days. In contrast, PCL-NPs released the entire amount of drug within 24 hours in both fluids. In addition, preliminary in vitro mucoadhesion studies were performed on polymeric NPs in liquid form (suspensions) to compare the possible variation of their potential mucoadhesive properties with those in powder form, which were tested directly on pig nasal mucosa tissue, where permeability was also assessed. CZP-loaded NPs showed some interactions with mucin during in vitro tests, but no mucoadhesiveness was shown ex vivo. Furthermore, permeation results indicate that using CZP-PCL-NPs didn’t increase the effective CZP permeating the mucosa; a faster onset of the permeation (20 min), compare to free CZP (40 min), and controlled profile were still demonstrated. Toxicity studies were conducted in vitro on primary human olfactory mucosa cells extracted from volunteer patients and on MDCKII cells. Finally, stability studies were conducted to evaluate the performance of NPs under various storage conditions (suspensions stored at 4°C and 25°C for 3 months; powders stored at 25°C with 50% relative humidity for 8 months) and under artificial physiological conditions in SNF at 35°C and in aCSF at 37°C. The results demonstrated the absence of aggregation phenomena in aCSF and in SNF, and NPs in powder form proved to be more stable. Paper VI (Rizzo et al. – Journal of Physics: Conference Series, 2022) is an extended abstract on food-grade polymers and their important role in prolonged DDSs. It offers an overview about polymers approved by EFSA and/or FDA for food and pharmaceutical industries. In particular, the polymers investigated are: alginate, chitosan, zein, pectin, inulin, starch, ethyl cellulose, shellac and natural gums, Eudraguard® copolymers. Paper VII (Rizzo et al. – Applied Sciences, 2023) is a review on advances in food carriers consisting of polymers approved by EFSA and/or FDA for targeted delivery of bioactive compounds to the colon. The polymers investigated are alginate, chitosan, zein, pectins, inulins, shellac gum, Eudraguard® copolymers, and natural gums. The review focuses on the technological characterisation and biological activity (morphology, size, surface charge, mucoadhesive properties, encapsulation efficiency, thermotropic behaviour, crystallinity, release profiles and kinetics, stability, in vitro and in vivo cytotoxicity, in vitro permeability, in vitro targeting efficiency) of these systems to assess their efficacy, safety and stability. In paper VIII (Lombardo et al., in progress) Eudraguard® Control (EUGC) was used as a food-grade polymer to produce a microcarrier matrix loaded with two natural neuroactive ingredients (NNIs), useful in the treatment of insomnia, for oral administration. EUGC is a food grade and generally recognised safe copolymer (GRAS) in the USA and is authorized in EU (with the E1205 code) for nutraceutical applications. This polymer was selected primarily for its ability to protect the active ingredients (AIs) from the acidic pH of the stomach and for its ability to ensure slow and controlled release at pH ≥ 6.8 (intestinal environment). MPs were prepared by the solvent evaporation method, which is easily scalable technique in the nutraceutical industry. The formulations were prepared at different ratios of NNI to polymer (1:10 or 1:20) and the suspensions were lyophilised in order to obtain a powder for the constitution of future dosage forms, such as tablets, sachets, granules or capsules. To avoid aggregation phenomena due to the freeze-drying process, a disaggregating agent was added. Subsequently, characterisation studies were conducted in the solid state (thermotropic behaviour, crystallinity, morphology, production yield, drug content, stability). The powders proved to be very stable when stored for 11 months 25°C with 50% relative humidity. In addition, in vitro studies were performed to assess the release kinetics of the MPs and potential mucoadhesive properties: in simulated gastric fluid (SGF), the MPs showed no interactions with mucin and the release of the encapsulated NNIs was minimal; on the contrary, in simulated intestinal fluid (SIF), the MPs interacted with mucin after 24 hours and the release of the NNIs increased significantly already after 30 minutes. Finally, an in vitro toxicity study was performed on MDCKII cells to confirm the biocompatibility of the microcarriers.

Le malattie del sistema nervoso centrale (SNC) (disturbi neurologici, neurodegenerativi e dell'umore) sono in rapido aumento e colpiscono un'alta percentuale della popolazione mondiale. I fattori eziologici possono essere genetici o provenienti dall'ambiente esterno, che perturbano l'omeostasi del cervello. In particolare, questo progetto di tesi si concentra sul trattamento di malattie come la neuroinfiammazione e il dolore acuto/cronico, la schizofrenia, l'epilessia e l'insonnia. I farmaci tradizionali, nelle loro forme farmaceutiche attuali e somministrati attraverso le vie di somministrazione classiche, presentano diversi limiti, come la scarsa aderenza terapeutica, la bassa biodisponibilità nel sito bersaglio (il cervello), gli effetti collaterali, i dosaggi elevati e le somministrazioni frequenti. Inoltre, i farmaci utilizzati presentano una scarsa solubilità nelle soluzioni acquose, con conseguente bassa permeazione attraverso le membrane biologiche e biodisponibilità. Le nanotecnologie hanno fornito molteplici vantaggi: la somministrazione di farmaci scarsamente solubili, aggirando membrane difficili da attraversare (come la barriera emato-encefalica, BBB), la somministrazione mirata al sito bersaglio con conseguente aumento della biodisponibilità del farmaco e riduzione dei dosaggi, la possibilità di un rilascio prolungato del farmaco con conseguente riduzione della frequenza di somministrazione, la protezione del farmaco dall'ambiente esterno (ad esempio, dagli enzimi di degradazione), la riduzione della distribuzione del farmaco in siti fuori bersaglio, con conseguente riduzione degli effetti collaterali. Inoltre, recentemente è stata studiata una via di somministrazione innovativa, la via intranasale (IN), poco invasiva e facile da autosomministrare. Ad oggi, è considerata dalla comunità scientifica una valida alternativa alla via parenterale, in quanto consente un'elevata velocità d'azione, poiché il farmaco può essere captato dal nervo olfattivo e raggiungere direttamente il cervello, bypassando la BBB, oppure essere assorbito rapidamente dalla mucosa nasale, che è altamente vascolarizzata, per raggiungere il cervello. Tuttavia, presenta molte sfide da superare (clearance muco-ciliare, bassi volumi di somministrazione, potenziale irritazione della mucosa nasale). L'obiettivo di questo lavoro di tesi è stato la progettazione, l'ottimizzazione, la preparazione e la caratterizzazione di nanoparticelle polimeriche (NPs) per la veicolazione IN di composti neuroattivi al cervello (sito target). I polimeri utilizzati sono stati selezionati per garantire il rilascio sostenuto dei composti neuroattivi sia a livello della mucosa nasale (via naso-sangue-cervello) sia a livello del liquido cerebrospinale (via naso-cervello, N2B), al fine di migliorare la biodisponibilità nel cervello dei farmaci selezionati: Diclofenac (DIC), Diclofenac epolamina (DIEP), clozapina (CZP) e carbamazepina (CBZ). In uno studio collaterale, sono state inoltre sviluppate e caratterizzate microparticelle polimeriche (MP) food-grade, adatte alla somministrazione orale, per la veicolazione di composti neuroattivi naturali (NNI), RL1 e RL2, utili nel trattamento dell'insonnia. Il polimero selezionato, oltre a essere "Generally Recognised as Safe" (GRAS) e ad aver ricevuto dall'EFSA la qualifica di prodotto alimentare, possiede proprietà gastroresistenti e può garantire un rilascio prolungato degli NNI nell'intestino tenue. Inoltre, la tecnica di preparazione utilizzata è facilmente scalabile e può essere applicata all'industria nutraceutica. L'articolo I (Lombardo et al. - Pharmaceutical Development and Technology, 2021) è una rassegna sui progressi delle nanotecnologie per la somministrazione di principi attivi (AI) attraverso la somministrazione IN. Questa rassegna si concentra sulla somministrazione IN descrivendo l'anatomia del naso, la BBB e le sue funzioni, il trasporto di farmaci dal naso al cervello e i vantaggi e gli svantaggi della somministrazione IN. Infine, riporta i progressi compiuti negli ultimi 10 anni dalle nanotecnologie relativi a sistemi di somministrazione IN di principi attivi, quali: microsfere, microparticelle mucoadesive (MP), microemulsioni, nanoparticelle polimeriche (NPs), NPs lipidiche solide (SLN), vettori lipidici nanostrutturati (NLC), NPs inorganiche, NPs proteiche virus-simili e auto-assemblanti (VLNP), dendrimeri, punti quantici (QDs), nanogel, nanoemulsioni (NEs) e liposomi. Nel lavoro II (Corsaro, Lombardo et al. - Applied Sciences, 2022) sono state sviluppate NPs polimeriche attraverso il metodo quasi-solvent evaporation emulsion (QESD) per la somministrazione IN di DIC e del suo sale di epolamina (DIEP). I farmaci sono stati incapsulati in una miscela di due polimeri, Eudragit® Retard RS100 e RL100, per garantire un rilascio sostenuto a livello della mucosa nasale e l'assorbimento del farmaco attraverso la mucosa per raggiungere il cervello (via naso-sangue-cervello). I lotti di NP ottimizzati sono stati caratterizzati per valutare il loro comportamento termotropico mediante calorimetria a scansione differenziale (DSC). Inoltre, questi polimeri sono stati selezionati per la loro carica cationica al fine di migliorare le proprietà mucoadesive delle NP, ideali per risiedere più a lungo nella cavità nasale e consentire un maggiore assorbimento del farmaco attraverso la mucosa nasale; sono state valutate le loro proprietà mucoadesive. Questo studio è stato condotto in vitro misurando la variazione del potenziale Zeta e il saggio turbidimetrico dopo l'incubazione delle NPs con la mucina nel fluido nasale simulato (SNF), rispetto alle sospensioni di farmaco puro. I risultati hanno mostrato che le NPs hanno mostrato forti interazioni con la mucina. La stabilità delle NP caricate con DIC e DIEP è stata valutata anche in SNF per prevedere potenziali fenomeni di aggregazione dopo la somministrazione nasale. Infine, gli esperimenti in vivo hanno dimostrato l'assenza di tossicità sulla mucosa nasale dei topi. Nel lavoro III (Lombardo et al. - Pharmaceutics, 2023) sono state formulate NPs polimeriche mucoadesive (miscela 1:1 di Eudragit® Retard, RS100 e RL100) per la somministrazione IN di clozapina (CZP). Le NPs hanno mostrato una dimensione di circa 400-500 nm, in grado di risiedere nella cavità nasale, dove il farmaco può essere rilasciato in modo prolungato e assorbito attraverso la mucosa nasale per raggiungere il cervello (via naso-sangue-cervello). Le NPs hanno mostrato un rilascio controllato di CZP fino a 8 ore. Inoltre, studi preliminari di mucoadesione in vitro hanno mostrato che le NPs presentavano già al tempo zero forti interazioni elettrostatiche con la mucina, dovute alla presenza della carica positiva dei copolimeri utilizzati. Per ridurre la clearance mucociliare, oltre alle proprietà mucoadesive, può essere utile la somministrazione di NPs in polvere. Questo sicuramente migliora anche la stabilità di conservazione della formulazione. Pertanto, la sospensione è stata liofilizzata utilizzando il 5% (w/v) di HP-β-CD come crioprotettore. Ciò ha garantito la conservazione delle dimensioni, del PDI e del potenziale zeta (ZP) delle NPs. Inoltre, sono stati condotti studi di caratterizzazione fisico-chimica delle NPs allo stato solido. Infine, sono stati eseguiti studi di tossicità in vitro su cellule MDCKII e cellule primarie di mucosa olfattiva umana e in vivo sulla mucosa nasale di topi CD-1. Questi ultimi hanno dimostrato la non tossicità delle NPs non caricate e lievi anomalie tissutali indotte dalle NP caricate con CZP. Nel lavoro IV (Bonaccorso et al. - Pharmaceutical Development and Technology, 2023) sono stati progettati e ottimizzati nanocristalli di carbamazepina (CBZ) per la somministrazione immediata e diretta di N2B. Le CBZ-NCs sono state preparate mediante tecnica solvent-antisolvent sonoprecipitation e la formulazione ottimizzata, attraverso l'approccio Quality by Design, ha mostrato una dimensione media di 291,2 nm ± 34,71 con una distribuzione quasi stretta (PDI ~ 0,4) e una carica neutra (ZP di -1,43 mV). La sospensione è stata convertita in polvere mediante processo di liofilizzazione, sotto crioprotezione con mannitolo al 5% (w/v). Gli studi di caratterizzazione sono stati condotti per valutare il comportamento termotropico, la cristallinità, la morfologia e il contenuto di farmaco. Studi preliminari di mucoadesione in vitro hanno mostrato una leggera interazione con la mucina (13,3% in 1 h e 6,6% in 24 h). Inoltre, gli studi di stabilità in vitro condotti nel fluido cerebrospinale artificiale (aCSF) non hanno mostrato alcuna aggregazione dei NCs. Infine, i NCs di CBZ non hanno mostrato segni di tossicità nelle cellule di ensheating olfattivo. Nel lavoro V (Lombardo et al., in corso) sono state sviluppate e ottimizzate NPs con due diversi polimeri, PLGA e PCL, per la somministrazione di CZP attraverso la via N2B. Le NPs sono state formulate con il metodo della deposizione con solvente e sono stati eseguiti studi di caratterizzazione allo stato solido, in vitro ed ex vivo per confrontare le diverse proprietà chimico-fisiche e biologiche delle PLGA-NPs e delle PCL-NPs. Le sospensioni ottenute sono state convertite nella formulazione finale in polvere, crioprotetta con il 5% (w/v) di D-maltosio per le PLGA-NPs e il 25% (w/v) di D-maltosio per le PCL-NPs. Le NPs hanno mostrato una dimensione di circa 200 nm, adatta alla ricaptazione dal nervo olfattivo per raggiungere direttamente il cervello, dove potrebbero rilasciare il farmaco. Gli studi di rilascio in vitro condotti in aCSF e SNF hanno dato i seguenti risultati: Le PLGA-NPs hanno rilasciato il 100% del farmaco in 4 giorni in SNF, mentre in aCSF hanno rilasciato circa l'80% in 20 giorni. Al contrario, PCL-NPs hanno rilasciato l'intera quantità di farmaco entro 24 ore in entrambi i fluidi. Inoltre, sono stati eseguiti studi preliminari di mucoadesione in vitro su NPs polimeriche in forma liquida (sospensioni) per confrontare la possibile variazione delle loro potenziali proprietà mucoadesive con quelle in polvere, che sono state testate direttamente sul tessuto della mucosa nasale di maiale, dove è stata valutata anche la permeabilità. Le NPs caricate con CZP hanno mostrato alcune interazioni con la mucina durante i test in vitro, ma non è stata dimostrata alcuna mucoadesività ex vivo. Inoltre, i risultati della permeazione indicano che l'uso di CZP-PCL-NPs non ha aumentato l'effettiva permeazione di CZP nella mucosa; sono stati comunque dimostrati un inizio più rapido della permeazione (20 minuti), rispetto a CZP libero (40 minuti), e un profilo controllato. Gli studi di tossicità sono stati condotti in vitro su cellule primarie della mucosa olfattiva umana estratte da pazienti volontari e su cellule MDCKII. Infine, sono stati condotti studi di stabilità per valutare le prestazioni delle NPs in varie condizioni di conservazione (sospensioni conservate a 4°C e 25°C per 3 mesi; polveri conservate a 25°C con il 50% di umidità relativa per 8 mesi) e in condizioni fisiologiche artificiali in SNF a 35°C e in aCSF a 37°C. I risultati hanno dimostrato l'assenza di fenomeni di aggregazione in aCSF e in SNF, mentre le NPs in polvere si sono rivelate più stabili. Il documento VI (Rizzo et al. - Journal of Physics: Conference Series, 2022) è un abstract esteso sui polimeri per uso alimentare e sul loro importante ruolo nei DDS a rilascio prolungato. Offre una panoramica sui polimeri approvati dall'EFSA e/o dalla FDA per le industrie alimentari e farmaceutiche. In particolare, i polimeri analizzati sono: alginato, chitosano, zeina, pectina, inulina, amido, etilcellulosa, gommalacca e gomme naturali, copolimeri Eudraguard®. Il documento VII (Rizzo et al. - Applied Sciences, 2023) è una rassegna sui progressi nei vettori alimentari costituiti da polimeri approvati dall'EFSA e/o dalla FDA per la somministrazione mirata di composti bioattivi al colon. I polimeri analizzati sono alginato, chitosano, zeina, pectine, inuline, gomma gommalacca, copolimeri Eudraguard® e gomme naturali. La rassegna si concentra sulla caratterizzazione tecnologica e sull'attività biologica (morfologia, dimensioni, carica superficiale, proprietà mucoadesive, efficienza di incapsulamento, comportamento termotropico, cristallinità, profili e cinetiche di rilascio, stabilità, citotossicità in vitro e in vivo, permeabilità in vitro, efficienza di targeting in vitro) di questi sistemi per valutarne efficacia, sicurezza e stabilità. Nel lavoro VIII (Lombardo et al., in corso) è stato utilizzato Eudraguard® Control (EUGC) come polimero food-grade per produrre una matrice di microcarrier caricata con due ingredienti neuroattivi naturali (NNI), utili nel trattamento dell'insonnia, per la somministrazione orale. L'EUGC è un copolimero di grado alimentare e generalmente riconosciuto sicuro (GRAS) negli Stati Uniti ed è autorizzato nell'UE (con il codice E1205) per applicazioni nutraceutiche. Questo polimero è stato selezionato principalmente per la sua capacità di per proteggere i principi attivi (AI) dal pH acido dello stomaco e per la sua capacità di garantire un rilascio lento e controllato a pH ≥ 6,8 (ambiente intestinale). Le MPs sono state preparate con il metodo dell'evaporazione del solvente, una tecnica facilmente scalabile nell'industria nutraceutica. Le formulazioni sono state preparate con diversi rapporti tra NNI e polimero (1:10 o 1:20) e le sospensioni sono state liofilizzate al fine di ottenere una polvere per la costituzione di future forme di dosaggio, come compresse, bustine, granuli o capsule. Per evitare fenomeni di aggregazione dovuti al processo di liofilizzazione, è stato aggiunto un agente disaggregante. Successivamente, sono stati condotti studi di caratterizzazione allo stato solido (comportamento termotropico, cristallinità, morfologia, resa produttiva, contenuto di farmaco, stabilità). Le polveri si sono dimostrate molto stabili se conservate per 11 mesi a 25°C con un'umidità relativa del 50%. Inoltre, sono stati eseguiti studi in vitro per valutare la cinetica di rilascio delle MPs e le potenziali proprietà mucoadesive: nel fluido gastrico simulato (SGF) le MPs non hanno mostrato interazioni con la mucina e il rilascio degli NNI incapsulati è stato minimo; al contrario, nel fluido intestinale simulato (SIF) le MPs hanno interagito con la mucina dopo 24 ore e il rilascio degli NNI è aumentato significativamente già dopo 30 minuti. Infine, è stato eseguito uno studio di tossicità in vitro su cellule MDCKII per confermare la biocompatibilità dei microcarrier.