NUOVE TECNICHE GENOMICHE APPLICATE AGLI AGRUMI PER L’OTTENIMENTO DI FRUTTI APIRENI

Seedlessness is a highly desirable trait for citrus fresh fruit and one of the factors that mainly contribute to its subsequent high market value. The presence of seed, often hard and having a bad taste are a big hindrance for consumers that prefer seedy fruits only when the seedless alternative is unavailable. In Citrus seedlessness is a complex trait and can be induced by different mechanisms, including the presence of triploidy, male or female sterility, parthenocarpy, if the fruit develops without ovules fertilisation, or stenospermocarpy, if the fruit contains partially formed seeds that have aborted after fertilization; another reason can be the presence of self-incompatibility (SI) reaction that prevents seed formation, especially if the variety is cultivated in isolated blocks in the absence of cross pollination. In order to elucidate and describe the genetic basis of SI mechanisms, an integrated approach based on both genomic and transcriptomic data was developed on clementine (Citrus clementina Hort. ex. Tan.), one of the most common varietal groups in the Mediterranean area. In particular, the genome of ‘Monreal’ clementine was de novo assembled and the S-genotype of ‘Comune’ clementine (self-incompatible) and its natural self-compatible mutant ‘Monreal’ was defined as S7S11; RNA-seq comparison of self-pollinated pistils from both genotypes identified 2,965 differentially expressed genes, most showing an oxidoreductase and transmembrane transport activity and revealed the lack of expression of S7-RNase in ‘Monreal’. These data compared to the reference genome enables the identification of 7,781 genes characterized by the presence of one or more SNPs among the two genotypes, mostly located on scaffold 7 containing the S locus suggesting their involvement in the SI regulation. The obtainment of seedless citrus varieties has been pursued for a long time using different techniques; the application of new-generation biotechnologies, also known as New Genomic Techniques (NGTs) represents a valid alternative to traditional techniques, such as hybridization, mutagenesis and selection, as it allows the introduction of precise modifications without altering the original genetic background of the variety considered. Among the NGTs, genome editing application seems powerful for the improvement of elite cultivars, especially for gene knockout or for the insertion of genes and mutations conferring novel features; in citrus it had been successful applied in editing genes involved in citrus canker susceptibility. Here, CRISPR/Cas9 system was successfully used to knock out IKU1, a gene involved in the regulation of seed size, since the loss of function mutations in HAIKU (IKU) pathway genes cause a decrease in the dimension of Arabidopsis mutant’s seed. Therefore, we used a dual-single guide approach on the homologous of IKU1 in citrus, transforming three seedy varieties, including two model species and one seedy sweet orange variety. Sixteen plants were analysed confirming that IKU1 gene and the translated protein were interrupted. In particular, among the edited plantlets, 4 samples displayed a large deletion of 327 bp present between the two cut sites of sgRNA1 and sgRNA2, while 2 samples showed an inversion. Phenotypic evaluations, that are still undergoing due to plant juvenility phase, will help to understand the role of IKU1 gene in HAIKU pathway and its importance for the obtainment of seedless new cultivars.

L’apirenia è una caratteristica molto ricercata negli agrumi e uno dei maggiori fattori che contribuisce al suo aumento di valore nel mercato. La presenza di semi nei frutti, spesso duri e di cattivo gusto, è un grande ostacolo per i consumatori che preferiscono i frutti con semi solo quando un’alternativa apirena non è disponibile. La mancanza di semi negli agrumi è un tratto complesso e può essere causato da diversi meccanismi quali ad esempio la presenza di sterilità maschile o femminile, la triploidia, la partenocarpia, quando la fecondazione dell’ovulo non avviene o la stenospermocarpia, quando invece lo sviluppo dei semi è interrotto a fecondazione avvenuta; in altri casi l’apirenia può essere causata da reazioni di auto-incompatibilità che impediscono la formazione del seme, specialmente se la varietà viene coltivata in blocchi isolati dove l’impollinazione incrociata è impedita. Per caratterizzare e descrivere le basi genetiche del meccanismo di auto-incompatibilità sono state studiate due varietà di clementina (Citrus clementina Hort. ex. Tan), uno dei gruppi varietali più diffusi nella regione Mediterranea. La cv. di clementine ‘Comune’ (auto-incompatibile) e la cv. ‘Monreal’, il suo mutante naturale auto-compatibile, sono state caratterizzate mediante un approccio integrativo che combina dati genomici e trascrittomici. In particolare è stato assemblato de novo il genoma di ‘Monreal’ ed è stato definito il genotipo del locus S delle due varietà, (‘Comune’ e ‘Monreal’) S7S11; il confronto delle reads ottenute tramite RNA-seq dei pistilli autoimpollinati di ‘Comune’ e ‘Monreal’ ha portato all’identificazione di 2965 geni differenzialmente espressi, molti dei quali sono responsabili di processi di ossidoriduzione e attività di trasporto trans-membrana e ha permesso di rilevare la mancanza di espressione dell’RNasi S7 in ‘Monreal’. Questi dati, allineati con il genoma di riferimento hanno permesso di identificare 7781 geni caratterizzati dalla presenza di uno o più SNP presenti nei due genotipi, per lo più localizzati nello scaffold 7, lo stesso che contiene il locus S, suggerendo il suo coinvolgimento nella regolazione dei geni coinvolti nell’auto-incompatibiltà. L’ottenimento di piante di agrumi apirene è stato perseguito a lungo utilizzando diverse tecniche; l’applicazione delle biotecnologie di seconda generazione, anche note come Nuove Tecniche Genomiche (NGTs) rappresenta una valida alternativa alle tecniche tradizionali, quali l’ibridazione, la mutagenesi e la selezione, in quanto consente di introdurre modifiche precise senza alterare il background genetico originale della varietà considerata. Tra questi, l'applicazione del genome editing in agrumi sembra molto promettente per il miglioramento di cultivar selezionate, specialmente per il silenziamento genico o per l’inserzione di geni e mutazioni che portano nuove caratteristiche; esso è stato applicato con successo per la modifica di geni coinvolti nella suscettibilità al cancro degli agrumi. In questa tesi, il sistema CRISPR/Cas9 è stato utilizzato con successo per silenziare il gene IKU1, coinvolto nella regolazione della dimensione del seme; la perdita di funzione delle mutazioni nei geni del pathway di HAIKU (IKU) causa una diminuzione della dimensione del seme nel mutante di Arabidopsis. Pertanto, è stato utilizzato un approccio a doppia guida per l’editing dell'omologo di IKU1 negli agrumi; la trasformazione è stata realizzata in tre genotipi di agrumi con semi, due specie modello e una varietà di arancio dolce. Sono state ottenute e analizzate sedici piante, confermando l’interruzione di sequenza nel gene IKU1 e l’assenza di alcuni amminoacidi nella proteina tradotta. In particolare, tra le piante editate, 4 campioni presentano una grande delezione di 327 bp tra le due guide sgRNA1 e sgRNA2, mentre 2 campioni presentano un’inversione. Le valutazioni fenotipiche, al momento non possibili a causa della lunga giovanilità, consentiranno di verificare e confermare il ruolo del gene IKU1 e la sua importanza per l’ottenimento di nuove varietà senza semi.