Emergenza clonale di resistenza al metotrexato nelle cellule PDX con codice a barre dell'osteosarcoma

Osteosarcoma is the most common primary malignant bone tumor in children, adolescents and young adults, with about 400 new cases that are registered every year in the United States. The efforts to generate new treatment options have been limited by the difficulty to better understand the osteosarcoma biology and the underlying mechanisms responsible for drug resistance. Different studies have demonstrated how intratumor heterogeneity arises as a consequence of the simultaneous coexistence of multiple sub-clonal populations and these subclones respond in different manner to chemotherapy. This behavior may be responsible for the drug resistance frequently observed in osteosarcoma. Therefore, in the present study we tried to evaluate the consequence of chromosomal instability and short macroevolutionary jumps in the resistance mechanisms to methotrexate (MTX) in osteosarcoma cells. In order to elucidate the clonal emergence of resistance to targeted and cytotoxic chemotherapy in osteosarcoma, thus we have worked on barcoding our cell lines derived from patient derived xenograft (PDX) models, then we generated resistant clones by treating the barcoded PDX cell lines with single agent Methotrexate (MTX). For each clone DNA has been extracted in order to perform sequencing of the DNA barcoded to determine if the genomic signature of the resistant clones is present in a subpopulation at the onset of treatment and if resistance is acquired through evolutionary selection or treatment-dependent modification. Functional assays of MTX resistance, by using [3H] Methotrexate for transport assay, further define the basis of the resistance that emerged. Gene expression analysis of the four genes involved in the mechanism of MTX resistance define the correlation to MTX Uptake and Resistance. The wide variability of the response to the selection applied by MTX to the PDX cells may be a result of short term cancer.

L'osteosarcoma è il tumore osseo maligno primario più comune nei bambini, negli adolescenti e nei giovani adulti, con circa 400 nuovi casi registrati ogni anno negli Stati Uniti. Gli sforzi per generare nuove opzioni terapeutiche sono stati limitati dalla difficoltà di comprendere meglio la biologia dell'osteosarcoma e i meccanismi sottostanti responsabili della resistenza ai farmaci. Diversi studi hanno dimostrato come l'eterogeneità intratumorale nasca come conseguenza della contemporanea coesistenza di più popolazioni subclonali e questi subcloni rispondano in maniera diversa alla chemioterapia. Questo comportamento può essere responsabile della resistenza ai farmaci frequentemente osservata nell'osteosarcoma. Pertanto, nel presente studio abbiamo cercato di valutare la conseguenza dell'instabilità cromosomica e dei brevi salti macroevolutivi nei meccanismi di resistenza al metotrexato (MTX) nelle cellule di osteosarcoma. Al fine di chiarire l'emergenza clonale della resistenza alla chemioterapia mirata e citotossica nell'osteosarcoma, abbiamo quindi lavorato sul codice a barre delle nostre linee cellulari derivate da modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX), quindi abbiamo generato cloni resistenti trattando le linee cellulari PDX con codice a barre con singolo agente Metotrexato (MTX). Per ogni clone è stato estratto il DNA al fine di eseguire il sequenziamento del DNA codificato a barre per determinare se la firma genomica dei cloni resistenti è presente in una sottopopolazione all'inizio del trattamento e se la resistenza è acquisita attraverso la selezione evolutiva o la modifica dipendente dal trattamento. Saggi funzionali di resistenza MTX, utilizzando [3H] Methotrexate per il saggio di trasporto, definiscono ulteriormente le basi della resistenza emersa. L'analisi dell'espressione genica dei quattro geni coinvolti nel meccanismo della resistenza MTX definisce la correlazione con l'assorbimento e la resistenza MTX. L'ampia variabilità della risposta alla selezione applicata da MTX alle cellule PDX può essere il risultato di un cancro a breve termine.