ALTERAZIONE DEL miRNoma INTRACELLULARE ED EXTRACELLULARE ED ANALISI BIOINFORMATICA IN MODELLI IN VITRO DI NAFLD E DI NASH

Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) represents the most common chronic liver disease in industrialized countries. NAFLD has the potential to progress through the inflammatory phase of nonalcoholic steatohepatitis (NASH) to fibrosis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. Identifying patients at risk for this transition is a relevant clinical challenge. The complexity of these phenotypes in vivo made necessary the development of in vitro models in order to dissect the molecular signalling affected in NAFLD and NASH, but also to identify potential circulating biomarkers. We profiled the expression of 754 cellular and medium-secreted human miRNAs in HepG2 cells after lipotoxic (Palmitate, model of NASH) or not-lipotoxic stimuli (Oleate-Palmitate, model of NAFLD). Results were validated through Single TaqMan assays. We performed computational analysis of miRNAs targets and pathways. Oleate-palmitate treatment induced a variation of 2.8% and 10% of total miRNAs in cells and medium, respectively; palmitate treatment caused 10% and 19% intracellular and extracellular miRNA deregulation, respectively. We validated miR-126, miR-150, miR-223, miR-483-3p, miR-1226*, and miR-1290 deregulation. Through computational analysis, we observed that targets of both intracellular and extracellular DE miRNAs were involved in processes associated with the onset and progression of NAFLD and NASH, such as fatty acid metabolism, apoptosis and inflammation. These data would be useful to elucidate the role of miRNAs in the pathogenesis and progression of the NAFLD spectrum, but they also allow the identification of novel potential biomarkers for differential diagnosis to be tested in vivo.

La steatosi epatica non alcolica (Non-alcoholic fatty liver disease NAFLD) interessa circa il 20-30% della popolazione generale e rappresenta la malattia epatica cronica più comune nei paesi industrializzati. La NAFLD presenta un potenziale evolutivo, attraverso la fase infiammatoria denominata NASH (Non-alcoholic Steato-Hepatitis), verso la fibrosi, la cirrosi ed in alcuni casi l'epatocarcinoma. L'identificazione dei pazienti a rischio evolutivo da NAFLD a NASH è una delle più importanti sfide in epatologia. La complessità molecolare delle due condizioni patologiche in vivo rende necessario lo sviluppo di modelli in vitro per lo studio delle vie di segnalazione e dei meccanismi molecolari compromessi o alterati nella NAFLD e nella NASH. In letteratura non sono ancora presenti dati High-throughput sull'espressione dei microRNA in modelli in vitro di NAFLD e di NASH. A tale scopo abbiamo analizzato l'espressione di 754 microRNA nelle HepG2 a seguito di trattamento con stimoli non lipotossici (Oleato:Palmitato, OA:PA) (modello di NAFLD) e a seguito di trattamento lipotossico (Palmitato, PA) (modello di NASH). Queste analisi sono state effettuate sia a livello intracellulare sia a livello extracellulare per i microRNA secreti nel mezzo di coltura. In questo modo abbiamo osservato che il trattamento con OA:PA determinava rispettivamente una variazione del 2.8% e del 10% dei microRNA totali rilevati nelle cellule e nel mezzo di coltura, mentre il trattamento con palmitato causava una deregolazione rispettivamente del 10% e del 19% dei microRNA intracellulari ed extracellulari. Mediante Single TaqMan Assay abbiamo validato la deregolazione dei seguenti microRNA: miR-126, miR-150, miR-223, miR-483-3p, miR-1226*, miR-1290. Utilizzando un nuovo approccio computazionale per l'analisi della perturbazione delle pathway, abbiamo riscontrato che i target dei microRNA intracellulari ed extracellulari erano coinvolti in processi cellulari e molecolari associati all'insorgenza ed alla progressione da NAFLD a NASH, come ad esempio il metabolismo degli acidi grassi, la regolazione di fattori di trascrizione lipogenici (ad esempio PPAR, SREbP), il metabolismo del glucosio, il metabolismo del recettore delle LDL, la risposta all'insulina, l'apoptosi e l'infiammazione. Il trattamento con PA, rispetto al trattamento con OA:PA, presentava un maggior arricchimento statisticamente significativo di funzioni associate alla NASH sia per i microRNA intracellulari che per i microRNA extracellulari DE. È stata analizzata l'espressione genica, mediante Real-Time PCR, di alcuni dei target dei microRNA differenzialmente espressi identificati. Questi dati potrebbero essere utili per identificare il ruolo dei microRNA nel metabolismo lipidico epatico e nella patogenesi e progressione dello spettro NAFLD; inoltre, se validati in vivo, potrebbero portare all'identificazione di nuovi microRNA epato-specifici come biomarcatori di diagnosi differenziale.