MicroRNA signature changes in human ovarian follicle in relation to reproductive aging

Small non-coding class of RNAs includes different types of molecules involved in different steps of RNA synthesis, processing, translation, as well as RNA modulation of transcription initiation, RNA degradation or protein synthesis block. Among these, microRNAs (miRNAs) represent the most studied and better characterized class of ncRNAs in terms of function and impact in human health and disease. miRNAs are short non-coding RNAs involved in the control of gene expression in different species. Specifically, miRNAs play a major role as master regulators of protein-coding genes. miRNA role in ovarian follicles has been characterized and the existence of miRNAs in human follicular fluid has been recently demonstrated. It was also reported that altered regulation of miRNA expression affects crucial pathways for follicle growth and oocyte maturation in several reproductive diseases. In addition, global miRNA analysis, on different tissues and organs and animal models has also shown that aging can influence mirna expression. Decreased female fertility with advanced maternal age has been widely documented. Although it is widely recognized that a key aspect that explains infertility in reproductive aging is the decline in oocyte quality, which also associates with higher risk of birth defects, genetic disorders and miscarriage, the molecular mechanisms underlying reproductive aging in female mammals are poorly understood. This thesis has aimed at evaluating impact of maternal age on miRNA expression profiles in human ovarian follicle and characterizing the pathways significantly affected by female ageing, identifying their regulator miRNAs. The manuscript includes three studies that for concision, they will be referred in the text, by Roman numerals, as Study I, II and III respectively. The Study I has been focused on the characterization of microRNAs in human follicular fluid (FF), the Study II on the miRNome changes in Follicular fluid exosomes from women of two different age groups; while miRNA identification in human MII oocyte and their expression profile changes in relation to reproductive aging have been shown in the Study III. Firstly, it was ascertained whether miRNAs are cargo of FF exosomes and whether they are involved in the regulation of follicle maturation. At a later stage, TaqMan Human microRNAs cards were performed to verify differently expressed miRNAs in FF respect with plasma samples, collected from 15 healthy women who underwent to intracytoplasmic sperm injections (ICSI). 37 miRNAs had significantly higher expression levels in human FF. 32 are carried by exosomes and involved in critically important pathways for follicle growth and oocyte maturation. Specifically, nine of them target and negatively regulate mRNAs expressed in the follicular microenvironment encoding inhibitors of follicle maturation and meiosis resumption. In order to reveal the contribution of miRNAs to female reproduction aging, we examined their expression changes during aging in human follicular fluid, using TLDA technology. Different miRNA distribution was found in FF exosomes from old and younger women. We detected about 50 miRNAs in FF exosomes which showed highly significant differences related to aging and were predicted to regulate ECM-receptor interaction, PI3K-Akt, p53, TGF-beta, HIF-1 and mTOR signaling pathways. Finally, we identified 57 miRNAs constantly expressed in 12 MII oocytes and 12 miRNAs displaying altered regulation in women of advanced reproductive age. By computational approach we explored the possible functions of differentially expressed miRNAs inside human germ cells, and confirmed experimentally miRNA differential expression in murine MII oocyte. Finally, a significant negative correlation miRNA-targets was found for miR-29a, miR-203 and specific mRNAs, that have been ascribed responsible for mechanisms modulating epigenetic changes underlying compromised oocyte quality caused by advanced maternal age.

La classe dei piccoli RNA non codificanti è stata descritta comprendere differenti tipi di molecole che sono coinvolte in differenti fasi della sintesi, processing e traduzione dell’RNA così come la modulazione dell’inizio della trascrizione, la degradazione dell’RNA o il blocco della sintesi proteica. Tra questi, i microRNA (miRNA) rappresentano la classe più studiata e meglio caratterizzata, in termini di funzione e impatto sulla salute umana. I miRNA agiscono come regolatori negativi dell’espressione genica in diverse specie. Nel follicolo ovarico il ruolo dei microRNA è stato caratterizzato, e l’esistenza nel fluido follicolare umano è stata recentemente dimostrata. Un alterata regolazione dell’espressione dei miRNA è stata, poi, riportata colpire pathway cruciali per la crescita del follicolo e la maturazione dell’ovocita in diverse patologie riproduttive. Inoltre, l’analisi globale di miRNA eseguita su differenti tessuti, organi e modelli animali ha anche mostrato che l’invecchiamento può influenzare l’espressione di queste piccole molecole di RNA. Il declino della fertilità femminile in relazione all’età è stato ampiamente documentato. Sebbene un aspetto chiave che spiega l’infertilità nell’invecchiamento riproduttivo è il declino della qualità ovocitaria, i meccanismi molecolari che ne stanno alla base sono ancora poco compresi. L’obiettivo di questa tesi è stato, pertanto, quello di valutare l’impatto dell’età materna sui profili di espressione dei miRNA nel follicolo ovarico umano e caratterizzare le pathways infuenzate in maniera significativa dal processo di invecchiamento, per identificarne i miRNA regolatori. Dunque, sono stati eseguiti: la caratterizzazione dei miRNA nel fluido follicolare umano (FF) (Study I), l’analisi dei cambiamenti di espressione del miRNoma negli esosomi del FF di donne di due diversi gruppi di età (Study II) ed infine, l’identificazione di miRNA in ovociti umani MII e l’analisi dei cambiamenti di espressione in relazione all’invecchiamento riproduttivo (Study III). Si è verificato, allora, che i miRNA fossero contenuti all’interno di esosomi e che fossero coinvolti nella regolazione della maturazione follicolare. In una seconda fase, attraverso il sistema delle TaqMan Human microRNAs card sono stati valutati i profili di espressione dei miRNA nel FF rispetto al plasma di donne che si sono sottoposte ad iniezione intracitoplasmatica dello spermatozoo (ICSI). Sono stati identificati 37 miRNA upregolati nel fluido follicolare umano. 32 sono stati rilevati all’interno di esosomi e sono stati trovati coinvolti in pathway importanti per la crescita follicolare e la maturazione dell’ovocita. In maniera specifica, 9 di essi regolano negativamente mRNA espressi nel microambiente follicolare codificanti inibitori della maturazione follicolare e della ripresa della meiosi. Per rivelare il contributo all’invecchiamento riproduttivo dei miRNA, abbiamo esaminato i cambiamenti di espressione nel FF, attraverso tecnologia TLDA. Una diversa distribuzione dei miRNA è stata trovata negli esosomi del FF tra donne di avanzata età riproduttiva (old) e donne più giovani (young). 50 miRNA contenuti in esosomi del FF, hanno mostrato differenze significative correlate all’invecchiamento e sono stati predetti regolare ECM-receptor interaction, PI3K-Akt, p53, TGF-beta, HIF-1 and mTOR signaling pathway. Infine, sono stati identificati 57 miRNA costantemente espressi in 12 ovociti MII e 12 mostranti alterata regolazione in donne di avanzata età riproduttiva. Attraverso un approccio computazionale, abbiamo esplorato le possibili funzione dei 12 miRNA all interno delle cellule germinali umane, e confermato l espressione differenziale in ovociti murini MII. Una significativa correlazione negativa miRNA-Target è stata trovata per il miR-29a, il miR-203 e mRNA imputati responsabili di meccanismi che modulano le modificazioni epigenetiche alla base della compromessa qualità ovocitaria causata dall’avanzata età materna.