Caratterizzazione microbiologica di ceppi di Bifidobacterium spp. e analisi chimica e biologica di un esopolisaccaride prodotto

The principle aim of research was to study the microbiological characteristics of Bifidobacterium spp. strains isolated from human and animal feces (sheep and goat) as well as those present in commercial probiotic products and to investigate the chemical - physical and the genotypic features of Bifidobacterium longum-eps clusters and biological properties. Several possible biological activities of the biopolymer produced by a strain of the examined Bifidobacterium longum were likewise investigated. Studies on the metabolic profile of the isolated strains, performed using standardized systems, confirmed only 10 strains to likely belong to the Bifidobacterium genus. These strains, assayed for resistance to gastrointestinal conditions, showed an appropriate resistance to pH 3.0 and different concentrations of bile salts. In addition, these strains, analyzed for their sensitivity to antibiotics, showed MICs compatible with the cut-off values reported by the EFSA (2012) for the genus Bifidobacterium . The strains isolated and characterized for the metabolic features such as bifidobacteria and the probiotic strains of Bifidobacterium spp. were assayed for adherence using a quantitative cultural method and observation with an optical microscope. The results showed different adhesion characteristics depending on the strain tested, and incubation. The adhesion capability of the strain B. longum W11, investigated by scanning electron microscopy, showed the presence of biopolymers organized in a complex 3D structure, exopolysaccharides-type , involved in adhesion. Subsequent phases of the survey, therefore, focused on studying this biopolymer of the exopolysaccharides-type . The purified and hydrolyzed EPS was analyzed for chemical composition by TLC, using silica and cellulose plates using methods developed by us. The presence of glucose and galactose was identified using both plates. A more accurate chromatographic analysis, carried out using HPLC, confirmed the presence of glucose and galactose in EPS polymer. The genetic determinants responsible for the synthesis of the EPS from the strain B. longum W11, performed by PCR using degenerate primers and a bioinformatic analysis, showed the presence of the cpsD gene and of a gene cluster composed of 23 genes, (24,7 kb). The possible cytotoxicity was tested in vitro using gingival fibroblasts HF1 and cancer cells Caco-2. The cytotoxicity assay performed on fibroblasts did not show any cytotoxic effect. The cytotoxicity assay, performed on Caco-2 cells, showed a modest decrease in cell viability starting from the lowest concentration tested. This decrease, however, was not statistically significant. The possible immunomodulatory activity of the EPS was verified in vitro by evaluating the effects on the production of cytokines pattern as IL-1, IL-6, IL-10 e IFN-gamma, using from PBMC from healthy donors. The results obtained showed an immunomodulating effect. The addition of EPS, at the highest dose, led to significant increased levels of IL-1, IL-6 and INF-gamma and significantly reduced levels of IL-10. The research results provide a good experimental basis for further investigation of general aspects of EPS not yet considered and, in particular, of EPS of B. longum W11 for protection of the strain producer from adverse intestinal conditions and/or the inhibiting characteristic of antibiotics and other possible biological properties.

Lo scopo della ricerca è stato quello di studiare le caratteristiche microbiologiche di ceppi di Bifidobacterium spp. isolati da feci umane e animali e da prodotti probiotici e quello di investigare le proprietà chimico-fisiche e alcune possibili attività biologiche dell’esopolisaccaride (EPS) prodotto da un ceppo di Bifidobacterium longum. Gli studi sul profilo metabolico dei ceppi isolati, eseguiti utilizzando sistemi standardizzati, confermavano soltanto per 10 ceppi la probabile appartenenza al genere Bifidobacterium spp. I ceppi caratterizzati come probabili bifidobatteri erano saggiati per la capacità di resistere alle condizioni gastrointestinali e mostravano resistenza a pH 3 e alle differenti concentrazioni di sali biliari saggiate. Inoltre, i 10 ceppi esaminati per la loro sensibilità agli antibiotici mostravano delle MIC compatibili con i valori di cut-off riportati dall’EFSA (2012) per il genere Bifidobacterium spp. I probabili bifidobatteri e i ceppi probiotici di Bifidobacterium spp. venivano studiati per la loro capacità di adesione, utilizzando le cellule HT-29, mediante metodo quantitativo colturale e osservazione mediante microscopio ottico ad immersione. I risultati mostravano differenti caratteristiche di adesione in relazione al ceppo saggiato, ma anche in relazione al tempo di incubazione. La capacità di adesione del ceppo Bifidobacterium longum W11 veniva ulteriormente indagata mediante microscopia elettronica a scansione che evidenziava la presenza di biopolimeri di probabile natura esopolisaccaridica, organizzati in una complessa struttura 3D e coinvolti nell’adesione del ceppo. Le successive fasi della ricerca erano, quindi, focalizzate sullo studio approfondito di questo biopolimero di natura esopolisaccaridica. Dopo l’estrazione, purificazione e idrolisi, utilizzando anche metodiche messe a punto da noi, l’esopolisaccaride (EPS) veniva analizzato per la composizione chimica, mediante TLC, utilizzando piastre in silice e in cellulosa. Entrambi i tipi di piastre permettevano di identificare la presenza di glucosio e galattosio, che veniva confermata con una più accurata analisi cromatografica effettuata mediante HPLC. La ricerca dei determinanti genetici responsabili della sintesi dell’EPS del ceppo B. longum W11 era effettuata mediante PCR e analisi bioinformatica dell’intero genoma. I risultati ottenuti mostravano la presenza del gene cpsD , che codifica per la galactosil-transferasi e un cluster genico composto da 23 geni, (24,7 kb). L’attività citotossica veniva saggiata in vitro su fibroblasti gengivali HF1 e tumorali Caco-2. Il saggio su fibroblasti non evidenziava alcun effetto citotossico, mentre quello su cellule tumorali Caco-2 mostrava una modesta diminuzione della vitalità cellulare sin dalla più bassa concentrazione saggiata. Tale decremento, tuttavia non era statisticamente significativo. L’eventuale attività immunomodulante dell’EPS era analizzata attraverso lo studio del pattern di citochine quali IL-1, IL-6, IL-10 e IFN-gamma, prodotte da cellule immunitarie isolate da PBMC di donatori volontari. I risultati hanno dimostrato per l’EPS in esame un effetto di tipo immunomodulante. Inoltre, quando l’EPS veniva saggiato in combinazione con ConA si evidenziava un incremento significativo dei livelli di IL-1, IL-6 e IFN-gamma e la riduzione significativa dei livelli di IL-10. I risultati della ricerca forniscono una buona base sperimentale per ulteriori indagini su altri aspetti non ancora investigati degli EPS ed in particolare dell EPS del ceppo B. longum W11, quali l’effetto protettivo sul ceppo produttore dalle condizioni intestinali avverse e/o dall’attività inibente degli antibiotici o altre eventuali proprietà biologiche.