Tracciabilità molecolare delle principali varietà di olivo (olea europaea l.) ed oli extravergine di oliva siciliani

The olive tree (Olea europaea L.) is one of the most representative plants of the Mediterranean area. In Sicily, there is a wide intraspecific variability and numerous accessions triggered not just by the reproductive biology, but also by the plurality of cultivation environments that characterize the island. In this context, the extra virgin olive oil is considered one of the highest quality product both for the high economic and commercial value and for nutritional and health factors. In particular, genetic differences, together with edaphic, climatic and agronomic conditions, are one of the factors that greatly influence the sensorial and organoleptic characteristics of the olive oils produced; then, the possibility to define the origin and varietal composition represents one of the key aspects of the traceability of extra virgin olive oils via molecular methodology. The PhD thesis was aimed at identifying the genetic differences on a wide number of olive tree accessions, through a morphological and molecular characterization of 24 accessions of three main cultivar of South-Eastern Sicily. Other objectives of the thesis have been to evaluate the efficiency of protocols for DNA extraction from extra virgin olive oil, by determining the extracted quantity and the genetic characterization of six Sicilian single-variety extra virgin olive oils. The analysis, both morphological and molecular, allowed to distinguish the main cultivars analysed as well as those accessions with intra-cultivar variability largely widespread in Eastern Sicily, opening up interesting perspectives regarding the possible applications of the results on clonal selection programs. In its entirety, the study realized via High Melting Resolution (HRM), represents the first investigation conducted on the polyclonal composition of some of the most important Sicilian cultivars, thus allowing to supply useful information for the definition of the genetic structure of the species in Sicily and for the varietal identification. The study of the genetic variability of the Sicilian olive cultivar has been parallel to the evaluation of different protocols for the extraction of DNA from extra virgin olive oils, by means of some methods of quantitative and qualitative analysis of the DNA obtained. Quantitative and qualitative analysis have been performed via QRT-PCR (Quantitative Real-Time PCR) and ddPCR (droplet digital PCR) that, combined, permitted an absolute quantification of the number of copies of the DNA of the analysed samples. The use of ddPCR, defined third generation PCR, applied for the first time on DNA in food, specifically on extra virgin olive oil, allowed an evaluation of the extraction protocols used, based on the real quality of the DNA obtained and on the evaluation of the number of copies of the amplified DNA. Molecular analysis via capillary electrophoresis (EC) of the DNA extracted from 6 single-variety olive oils with microsatellite markers was aimed at the definition of a molecular characterization protocol of the olive oil able to compare the genetic profile of the DNA extracted from the leaves of the same varieties. The extraction of DNA from extra virgin olive oil provide the basics for setting up a genetic Identity card of the single-variety PDO and PGI extra virgin olive oils that can be used as a supplement to the documental traceability, representing a tool of protection.

L'olivo (Olea europaea L.) è una delle piante più rappresentative dell’ambiente mediterraneo. In Sicilia, è presente con una molteplicità di accessioni e un’ampia variabilità intraspecifica, determinata non solo dalla biologia riproduttiva, ma anche dalla pluralità degli ambienti di coltivazione che contraddistingue l’isola. L'olio extravergine di oliva, in questo contesto, è considerato uno dei prodotti di maggior qualità sia per l’elevato valore economico-commerciale, sia per gli aspetti nutrizionali e salutistici. In particolare, le differenze genetiche sono uno dei fattori che contribuiscono maggiormente, insieme alle condizioni edafiche, climatiche e agronomiche, sulle caratteristiche sensoriali e organolettiche degli oli prodotti; la possibilità di definire, quindi, l’origine e la composizione varietale, rappresentano uno degli aspetti fondamentali al fine della tracciabilità degli oli extravergine di oliva mediante metodologia molecolare. Il lavoro di tesi di Dottorato ha avuto lo scopo di identificare le differenze genetiche su un ampio numero di accessioni di olivo, mediante una caratterizzazione morfologica e molecolare di 24 accessioni appartenenti a tre principali cultivar della Sicilia Sud-Orientale. Ulteriori obiettivi della tesi sono stati la valutazione dell’efficienza di protocolli di estrazione di DNA da olio extravergine di oliva, determinandone la quantità estratta e la caratterizzazione genetica di sei oli extravergine monovarietali di oliva siciliani. Le analisi di carattere morfologico e molecolare hanno, quindi, permesso di discriminare le principali cultivar analizzate, nonché quelle accessioni considerate cloni delle cultivar maggiormente diffuse nella Sicilia orientale, aprendo interessanti prospettive per quanto riguarda possibili applicazioni dei risultati per programmi di selezione clonale. Nel complesso lo studio realizzato tramite High Melting Resolution (HRM) costituisce la prima indagine condotta sulla composizione policlonale di alcune tra le più importanti cultivar siciliane, consentendo di fornire informazioni utili per la definizione della struttura genetica della specie in Sicilia e per l’identificazione varietale. Lo studio della variabilità genetica della popolazione clonale siciliana è stato affiancato alla valutazione di diversi protocolli di estrazione di DNA da olio extravergine di oliva, mediante l’ausilio di alcuni metodi di analisi quantitativa e qualitativa del DNA ottenuto. Le analisi quantitative e qualitative sono state effettuate mediante QRT-PCR (Quantitative Reverse Transcription PCR) e mediante ddPCR (droplet digital PCR) che, in combinazione, hanno consentito una quantificazione assoluta del numero di copie del DNA dei campioni in analisi. L’utilizzo della ddPCR, definita PCR di terza generazione, applicata per la prima volta su DNA di matrice alimentare, in particolare su olio extravergine di oliva, ha consentito una valutazione dei protocolli di estrazione utilizzati, basati sulla reale qualità del DNA ottenuto e sulla valutazione del numero di copie del DNA amplificato. L’analisi molecolare mediante Elettroforesi Capillare (EC) del DNA estratto da 6 oli monovarietali, con marcatori microsatelliti è stata finalizzata alla definizione di un protocollo di caratterizzazione molecolare dell’olio di oliva, che ha consentito di comparare il profilo genetico del DNA estratto dalle foglie con quello del corrispettivo olio, permettendo di valutare la corrispondenza dei risultati attesi. L estrazione di DNA da olio extravergine di oliva, con un focus particolare sulle cultivar siciliane e la possibile applicazione altre tipologie di marcatori molecolari creano i presupposti della costituzione di una auspicata Carta d identità genetica degli oli extravergini d oliva monovarietali con marchi DOP e IGP da poter utilizzare come complemento alla tracciabilità documentale e che potrebbe, dunque, rappresentare uno strumento di tutela.