Phenotypic and transcriptional analysis of secondary metabolites production in Pseudomonas corrugata CFBP5454

Natural products have received a great deal of attention as sustainable alternative for management of plant diseases. In this study the potential and actual arsenal of secondary antimicrobial metabolites of the bacterium Pseudomonas corrugata, an ubiquitous bacterium, was dissected by phenotypic assays, genome mining and transcriptional studies. Pseudomonas corrugata strain CFBP 5454 was shown to produce diffusible compounds that inhibit the growth of plant pathogenic fungi and bacteria and antifungal volatile compounds and to produce cyanide. Mutant derivatives in LuxR transcriptional regulators, i.e. P. corrugata GL2 (pcoR mutant) and GLRFIA (rfiA mutant) impaired in cyclic lipopeptide (CLP) production, showed a diffusible compound-mediated reduced activity, depending on the biocontrol strain, challenge microorganism and culture medium but clearly indicate the production of additional antimicrobial substances. PcoR is the cognate receptor of the N-acyl-homoserine lactones, synthetised by PcoI in P. corrugata quorum sensing (QS) system. The QS system also directly activates the transcriptional regulator gene rfiA. In order to define the complete regulon of PcoR and RfiA, deep sequencing of cDNA library (RNA-seq) was used to analyse the whole transcriptomes of GL2 (pcoR-) and GLRFIA (rfiA-) mutants at early stationary phase of growth on a minimal medium. Differential expression analysis between the Wt and the mutants showed that the CLP cormycin and corpeptins biosynthetic clusters as well as that of an additional putative bioactive peptide and the exopolisaccharide alginate are under the control of the PcoR-RfiA regulon. Quantitative Real-time PCR assays demonstrated that CLP genes are upregulated in minimal medium and plant growth conditions as compared to reach medium cultures, whereas alginate production and biosynthesis gene expression were upregulated in rich growth conditions. In addition this study shows that citronellol is able to inhibit the growth of plant pathogenic bacteria but also could interfere with Quorum sensing system mediated by medium chain AHL in the biosensor strain Chromobacterium violaceum and in P. corrugata with QS system and the expression of genes contributing to the production of CLPs.

I prodotti naturali sono oggetto di grande interesse come alternativa sostenibile per la gestione delle malattie delle piante. In questo studio è stato valutato, mediante saggi fenotipici, analisi del genoma e studi di trascrizione, il potenziale ed effettivo arsenale di metaboliti secondari antimicrobici prodotti dal batterio ubiquitario Pseudomonas corrugata. E stato dimostrato che, il ceppo di P. corrugata CFBP 5454, produce composti diffusibili che inibiscono la crescita di funghi e batteri patogeni e composti volatili antifungini tra cui acido cianidrico. Ceppi batterici inattivati nei geni che codificano per i regolatori trascrizionali LuxR, P. corrugata GL2 (pcoR-) e GLRFIA (rfiA-), in cui la produzione di lipopeptidi ciclici (CLP) risulta alterata, hanno mostrato un'attività antimicrobica ridotta, a seconda del ceppo batterico, patogeno e substrato, ma indicano chiaramente la produzione di ulteriori sostanze antimicrobiche. PcoR è il recettore degli acil-omoserina lattoni sintetizzati da PcoI nel sistema di regolazione Quorum sensing (QS). Il sistema QS, inoltre, attiva direttamente il gene rfiA codificante per un altro regolatore trascrizionale della famiglia LuxR. Al fine di definire quali siano i geni regolati da PcoR ed RfiA, è stato analizzato il trascrittoma dei mutanti GL2 (pcoR-) e GLRFIA (rfiA-) attraverso il sequenziamento delle librerie di cDNA, ottenute da colture all inizio della fase stazionaria coltivate in substrato minimo. L'analisi dei geni differenzialmente espressi tra il ceppo parentale e i mutanti, ha dimostrato che i cluster biosintetici dei CLP cormicina e corpeptine, e quello di un addizionale putativo peptide bioattivo, nonchè dell esopolisaccaride alginato, sono sotto il controllo trascrizionale del regulone PcoR-RfiA. Saggi di Real-time PCR quantitativa hanno dimostrato che i geni CLP sono sovraespressi in condizioni di crescita su substrato minimo e in pianta rispetto a colture in substrato ricco, mentre i geni responsabili della biosintesi di alginato sono sovraespressi in condizioni di crescita su substrato ricco. Inoltre, in questo studio, è stato dimostrato che il citronellolo è in grado di inibire la crescita dei batteri fitopatogeni e i risultati suggeriscono possa interferire con il sistema di regolazione Quorum sensing mediato da AHL a catena media del ceppo biosensore Chromobacterium violaceum, e con quello di P. corrugata interferendo indirettamente con i geni che contribuiscono alla produzione di CLP in P. corrugata.