Analisi dell espressione delle Chitinasi e dei geni ad esse correlati nei soggetti esposti ad agenti inquinanti e al fumo di sigaretta

Introduction. Chitinases belonging to 18 glycosyl hydrolase family are a group of enzymes capable to interact with chitin. Several studies have demonstrated that these molecules are expressed in innate immune cells and are involved in various pathological conditions such as cancer, diabetes, neurological disorders, osteolytic process, acute and chronic inflammations. CHIT1 is the best-characterized true chitinase from a clinical and biological perspective. Several studies reporting recessive inherited deficiency in CHIT1 activity. The defect, frequently encountered in different ethnic groups, consists of 24-bp duplication in exon 10 that activates a cryptic 39-splice site in the same exon. The spliced mRNA encodes an enzymatically inactive protein that lacks an internal stretch of 29 amino acids. The Chitinases are produced in the respiratory tract by alveolar macrophages and they are involved in numerous respiratory diseases (COPD, asthma).The aim of this study was to investigate the Chitinases modulation in blood samples of two groups of subjects, exposed to pollutants and not exposed. We also evaluated the effect of CHIT1 polymorphism in the outcome of the respiratory functions of the subjects recruited in our study. Materials and Methods. In this study, we recruited 49 workers professionally exposed to pollutants and 25 healthy controls, not exposed. For further statistical analysis, the two groups were subdivided into smokers and non smokers. All subjects have been genotyped for the CHIT1 24bp polymorphism in order to identify the frequency of distribution. Furthermore, CHIT1 enzymatic activity was tested in the plasma of subjects by fluorimetric test. Ex vivo and in vitro study were conducted on PBMCs in order to evaluate the expression of Chitinases (CHIT1, CHIA, CHI3L1, CHI3L2 and CHID1) and the cytokines (TNFa, IL1b, IL6, CCL2, CXCL5, CXCL1, CXCL3, CXCL6, CXCL8, CXCL2) involved in the inflammatory pathways. In addition, we used the NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) database in order to analysed a transcriptome dataset of alveolar macrophages isolated by bronchoalveolar wash (BAL) from smokers and not smokers. Results. The polymorphism frequency analysis confirmed the bibliographic data. The 52% were homozygous (AA) wild type, 41% heterozygous (Aa) and the 7% homozygous (aa) mutated. Relevant results were obtained during the analysis of pulmonary function in professional exposed groups. We showed that the CHIT1 24bp-polymorphism in heterozygotes smokers improved the pulmonary performance compared to wild-type homozygous. As regard the plasma levels of CHIT1 activity, we have demonstrated that were increased in workers professional exposed and smokers compared to respective control groups. The analysis of Chitinase genes expression in PBMCs isolated from workers professional exposed and from control groups showed no significant modulations. The in vitro treatment of PBMCs isolated from healthy donor showed surprisingly results. The treatment with Benzenetriol for 24 hours (5micromol) was able to reduced significantly the CHIT1 and CCL2 mRNA expressions and increase the expressions of TNFa and other members of the chemokines family. The analysis of alveolar macrophages dataset showed a significantly increase expression levels of CHIT1 and CHI3L1 in smokers compared to the control group. Conclusions. In conclusion, our study demonstrated for the first time that the CHIT1 24bp polymorphism could have a protective effect on subjects daily exposed to pollutants or to cigarette smoke. In addition, the acute and chronic exposition to the pollutants coming from both the environment and the social habits was able to modulate the Chitinase genes pathways. All together, these results demonstrate that the Chitinases could be predictive molecular biomarkers for the progression of pulmonary disease.

Le Chitinasi appartengono alla famiglia 18 delle glicosil-idrolasi e sono un gruppo di enzimi capaci di interagire con la chitina. Diversi studi hanno dimostrato che queste molecole sono espresse dalle cellule dell immunità innata e sono coinvolte in differenti condizioni patologiche come cancro, diabete, disordini neurologici, processi osteolitici e infiammazione cronica e acuta. La CHIT1 è la chitinasi più caratterizzata dal punto di vista clinico e biologico. Diversi gruppi etnici presentano un polimorfismo della CHIT1 che consiste nella duplicazione di 24pb nell esone 10 che genera un mRNA anomalo codificante per una proteina enzimaticamente inattiva. Le Chitinasi sono prodotte nel tratto respiratorio dai macrofagi alveolari e sono coinvolte in numerose patologie respiratorie (asma,BPCO). Lo scopo di questo studio è stato analizzare i livelli di espressione delle Chitinasi nel sangue periferico di soggetti esposti ad inquinanti ambientali e controlli non esposti. Inoltre, è stato valutato se la presenza del polimorfismo influenzava la funzionalità respiratoria nei soggetti esposti reclutati per lo studio. Materiali e metodi Sono stati reclutati 49 lavoratori professionalmente esposti ad inquinanti ambientali e 25 controlli non esposti. I due gruppi sono stati suddivisi in fumatori e non fumatori. I soggetti reclutati nello studio sono stati genotipizzati per poter stabilire la frequenza del polimorfismo di 24pb. L attività enzimatica della CHIT1 è stata misurata mediante un test fluorimetrico. I PBMCs sono stati utilizzati per gli studi in ex vivo ed in vitro al fine di misurare l espressione delle Chitinasi (CHIT1, CHIA, CHI3L1, CHI3L2 e CHID1) e delle citochine (TNFa, IL1b, IL6, CCL2, CXCL5, CXCL1, CXCL3, CXCL6, CXCL8, CXCL2) coinvolte nei processi infiammatori. Alcuni dati di questo studio sono stati acquisiti utilizzando un dataset di microarray costituito dal trascrittoma di macrofagi alveolari di soggetti fumatori e controlli non fumatori. Risultati L analisi della frequenza del polimorfismo ha confermato i dati presenti in bibliografia: il 52% dei soggetti erano omozigoti wild-type (AA), il 41% eterozigoti (Aa) e il 7% omozigoti mutati (aa). Il dato interessante ha riguardato l analisi della funzionalità polmonare nel gruppo di soggetti professionalmente esposti. Questo studio ha dimostrato che i soggetti fumatori eterozigoti per il polimorfismo di 24pb avevano una migliore performance polmonare rispetto ai soggetti omozigoti wild-type. L attività enzimatica della CHIT1 era aumentata nei soggetti fumatori professionalmente esposti rispetto ai relativi controlli. L analisi dell espressione genica delle Chitinasi nei PBMCs isolati dai soggetti professionalmente esposti e dai controlli, invece, non mostrava alcuna modulazione significativa. I trattamenti in vitro dei PBMCs isolati dai controlli sani hanno rivelato un risultato interessante. Il trattamento con Benzenetriol alla concentrazione di 5µM per 24h era in grado di ridurre significativamente i livelli di espressione dell mRNA di CHIT1 e CCL2 e di aumentare l espressione del TNFa e di altri membri della famiglia delle chemochine. L analisi del trascriptoma dei macrofagi alveolari ha mostrato un significativo aumento dei livelli di espressione di CHIT1 e della CHI3L1 nei soggetti fumatori rispetto ai controlli. Conclusioni In conclusione, il nostro studio ha dimostrato per la prima volta che il polimorfismo di 24pb del gene della CHIT1 potrebbe avere un effetto protettivo nei soggetti esposti quotidianamente a sostanze inquinanti o al fumo di sigaretta. Inoltre, l esposizione acuta e cronica ad inquinanti ambientali era capace di modulare i pathways dei geni appartenenti alla famiglia delle Chitinasi. Questi risultati dimostrano che le Chitinasi potrebbero essere considerate dei biomarcatori predittivi molecolari per lo studio della progressione delle malattie polmonari.