Modulating activity of vancomycin and daptomycin on the expression of gene involved in reduced glycopeptide susceptibility in Staphylococcus aureus

In the last decade the increased use of vancomycin and teicoplanin (glycopeptides), as the first-line antibiotics for the therapy of infections due to Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA), has led to the emergence of Vancomycin Intermediate Staphylococcus aureus i.e. heterogeneous Vancomycin-Intermediate-Staphylococcus aureus (hVISA) and homogeneous Vancomycin-Intermediate-Staphylococcus aureus (VISA). The genetic basis of reduced vancomycin susceptibility has been the subject of different papers: numerous genes (autolytic, cell-wall turnover and cell-envelope positive charge) and regulatory loci have been reported to be associated with glycopeptide intermediate resistance. Moreover, some recent papers reported a positive correlation between vancomycin and daptomycin reduced susceptibility but the molecular machinery involved in this cross resistance, and the molecular and phenotypic changes of hVISA and VISA strains are not well understood. The goal of our study was to investigate: the molecular basis of vancomycin reduced susceptibility, and the activity of vancomycin and daptomycin on the expression of the genes involved. The study was performed on a sample of strains including VSSA, hVISA and VISA, grown with or without vancomycin or daptomycin, and carried out by phenotypic assay (autolysis in Triton x-100, ¿-haemolysin production on 5% sheep blood agar) and by quantitative relative real time RT-PCR on the genes involved in: autolysis (atl, lytM), cell-wall turnover (sceD), membrane charges (mprF, dltA) and regulatory mechanisms (agr locus, graRS, walRK). Our results show that hVISA and VISA strains, with respect to VSSA, are characterized by an up-regulation of sceD, a down-regulation of rnaIII (agr locus) and an up-regulation of mprF in Mu3 (hVISA) and dltA in Mu50 (VISA). The VISA strain, in addition, is characterized by a down-regulation of atl and lytM genes versus hVISA and, obviously, VSSA. At the light of these results we can conclude that hVISA and VISA strains possess an increased cell-wall turnover and positive charge, but a reduced agr locus functionality: these features are responsible for reduced vancomycin susceptibility and this distinguishes hVISA and VISA from VSSA. Furthermore, the VISA phenotype comes out from hVISA when it acquires a reduced both autolysis and net negative cell-envelope charge. Another outcome is that vancomycin and daptomycin act in the same way, stimulating hVISA to acquire the VISA behaviour and increasing, in VISA, the cell-wall pathway at the basis of the intermediate vancomycin phenotype. Moreover, daptomycin induces a charge repulsion mechanism in hVISA and VISA due to mprF up-regulation.

Negli ultimi dieci anni l'aumentato uso di vancomicina e teicoplanina (glicopeptidi), come antibiotici di prima linea nel trattamento di infezioni causate da Staphylococcus aureus meticillino-resistenti (Methicillin Resistant S.aureus-MRSA), ha portato all'insorgenza di ceppi con ridotta sensibilità a vancomicina noti come heterogeneous Vancomycin-Intermediate S.aureus (hVISA) e Vancomycin-Intermediate S.aureus (VISA). Le basi genetiche della ridotta sensibilità a vancomicina sono state oggetto di numerosi lavori scientifici, che hanno riportato il coinvolgimento di diversi geni (autolitici, implicati nel turnover del cell-wall e nella carica positiva netta di parete) e loci regolatori; ma i cambiamenti molecolari e fenotipici alla base dei fenotipi hVISA e VISA non sono ancora stati del tutto chiariti. Recenti pubblicazioni, inoltre, hanno mostrato la presenza di una correlazione positiva tra la ridotta sensibilità a vancomicina e quella a daptomicina, ma il macchinario molecolare alla base di tale cross resistenza non è ancora stato spiegato. Lo scopo del nostro lavoro è stato quello di studiare le basi molecolari della ridotta sensibilità a vancomicina e l¿attività di vancomicina e daptomicina sull¿espressione di geni coinvolti nel fenotipo di ridotta sensibilità ai glicopeptidi. Lo studio è stato condotto su un campione di ceppi VSSA, hVISA e VISA, analizzati in presenza ed in assenza di concentrazioni sub-inibenti di vancomicina o daptomicina nel terreno di coltura. Il piano sperimentale ha previsto: saggi fenotipici (saggi di autolisi in Triton x-100, saggi di ¿-emolisi su piastre di agar sangue di montone al 5%) e saggi quantitativi relativi di real time RT-PCR sui geni coinvolti nell¿autolisi (atl, lytM), nel turnover del cell-wall (sceD), nelle cariche positive nette di parete (mprF, dltABCD) e nei meccanismi di regolazione (agr, graRS, walRK). I risultati di real time RT-PCR quantitativa relativa mostravano una up-regolazione di sceD e una down-regolazione di rnaIII (agr locus) nei ceppi hVISA e VISA, rispetto al VSSA; inoltre, era presente una up-regolazione di mprF in Mu3 (hVISA) e di dltA in Mu50 (VISA). Il ceppo VISA, inoltre, era caratterizzato da una down-regolazione di atl e lytM rispetto ad hVISA e VSSA. Alla luce di questi risultati possiamo concludere che le caratteristiche alla base della ridotta sensibiltà a vancomicina che distinguono i fenotipi hVISA e VISA da quello VSSA sono: un aumento del turnover cellulare e delle cariche positive di parete ed una ridotta funzionalità di agr locus. Possiamo aggiungere inoltre che, il fenotipo VISA emerge da quello hVISA quando quest¿ultimo acquisisce una ridotta autolisi e una riduzione delle cariche negative nette di parete. Per quanto riguarda l¿attività modulatoria di vancomicina e daptomicina, i nostri saggi di espressione ci portano a concludere che le due molecole antimicrobiche agiscano nella medesima maniera, cioè spingendo l¿hVISA ad acquisire un comportamento da VISA, e aumentando nel VISA il pathway del cell-wall che rappresenta il fattore chiave nel fenotipo di ridotta sensibilità ai glicopeptidi. Daptomicina, inoltre, up-regolando mprF in hVISA e VISA induce, in questi fenotipi, un meccanismo di repulsione di carica.