Specific Alterations of miRNA Transcriptome and Global Network Structure in Colorectal Cancer After Inhibition of MAPK/ERK Signaling Pathway

Il carcinoma del colon-retto (CRC) è uno dei tumori più frequenti nelle società occidentali. Attualmente, il più comune agente utilizzato nella terapia del CRC è il cetuximab, un anticorpo monoclonale, somministrato da solo o in associazione alla chemioterapia. Non tutti i pazienti rispondono allo stesso modo alla terapia con il cetuximab: l unico marcatore molecolare universalmente accettato per predire la risposta del paziente è lo stato mutazionale di KRAS nel sito del tumore, un indagine invasiva che richiede un prelievo bioptico dal paziente. Per ragioni ancora del tutto da chiarire, tuttavia, anche alcuni pazienti privi della mutazione del gene KRAS, potenziali beneficiari del trattamento con cetuximab, risultano refrattari alla terapia. Molti sforzi sono stati fatti per identificare nuovi potenziali biomarcatori diagnostici e prognostici dal sangue periferico o altri fluidi biologici. I miRNA, piccole molecole di RNA coinvolte in tutti gli aspetti del metabolismo cellulare attraverso la regolazione dell espressione genica, sono nuovi importanti biomarcatori per molte patologie e tumori, incluso il CRC. La ricerca scientifica è volta all identificazione di nuove molecole altamente specifiche contro i componenti dei circuiti molecolari coinvolti nei tumori. La via molecolare principalmente alterata nel CRC è quella delle MAPK, i cui membri sono potenziali target per inibitori specifici allo scopo di superare i problemi associati alla non responsività dei pazienti alla terapia contro l EGFR. Questa tesi è focalizzata sull identificazione della relazione tra la risposta a certi tipi di inibitori e l alterazione del trascrittoma dei miRNA in linee cellulari umane di CRC, in base alla presenza/assenza di mutazione a livello del gene KRAS. Abbiamo analizzato l espressione di 667 miRNA in due linee cellulari di CRC (Caco-2 ed HCT-116, KRAS wild-type e mutato, rispettivamente), e 745 miRNA in tre linee cellulari di CRC (Caco-2, HCT-116 ed SW-620, un altra linea con KRAS mutato), dopo trattamento con cetuximab e dopo somministrazione di tre inibitori specifici della via delle MAPK. Il nostro obiettivo è stato individuare tipici profili di espressione dei miRNA associati alla risposta al cetuximab, nonchè l identificazione del coinvolgimento dei miRNA all interno della via delle MAPK. La prima analisi ha permesso l identificazione di un set unico di miRNA differenzialmente espressi nella linea sensibile rispetto alla linea resistente. L analisi delle network sui target di questi miRNA suggerisce un loro ruolo in processi correlati al cancro, e rivela la presenza di nodi critici coinvolti nell internalizzazione dell EGFR. La seconda analisi ha portato all identificazione di sei miRNA differenzialmente espressi (miR-372, miR-663b, miR-1226*, miR-92a-1*, miR-135b* e miR-720), coinvolti nei processi di migrazione, proliferazione, apoptosi, e nei circuiti regolatori centrati sulla via delle MAPK. Abbiamo analizzato l espressione dei principali miRNA candidati in entrambi gli studi in biopsie da pazienti CRC precedentemente suddivisi in base alla presenza/assenza di mutazioni del gene KRAS: due miRNA dal primo studio (miR-146b-3p e miR-486-5p) e quattro dal secondo (miR-92a-1*, miR-135b*, miR-372, miR-720) sono sovraespressi nei pazienti CRC rispetto ai controlli. Di questi, quattro sono sovraespressi nei pazienti con KRAS mutato rispetto ai non mutati. L identificazione di miRNA la cui espressione è associata all efficacia della terapia potrebbe favorire la predizione della risposta alla terapia, e mettere in luce i meccanismi coinvolti nella resistenza farmacologica. I nostri risultati contribuiscono ad approfondire la conoscenza della via delle MAPK, individuando nuovi potenziali oncomiRs in CRC, e permettendo la loro applicazione nella pratica clinica. I dati mostrati in questa tesi sono stati pubblicati nel 2010 nella rivista Moleular Cancer Therapeutics e nel 2012, nella rivista Journal of Molecular Medicine.

Colorectal cancer (CRC) is one of the most frequent malignancies affecting western societies. Currently, the gold standard of CRC treatment is cetuximab, a monoclonal antibody, alone or in combination with chemotherapy. Not all patients positively respond to cetuximab: the analysis of KRAS mutational status at tumor site, a highly invasive analysis, is the only universally accepted genetic predictor for patient s response. However, some KRAS wild type patients, potential good responders, don t benefit from this therapy. To overcome these obstacles, research is focusing on the identification of new biomarkers detectable in circulating blood or other body fluids that can be used for diagnosis as well as for predicting the response to certain therapies. miRNAs, small RNA molecules involved in all aspects of cellular metabolism through regulation of gene expression, have been identified as new biomarkers for many diseases and cancers, including CRC. On the other hand, the scientific research is investigating on new molecules providing high specificity for the key players of the main cellular pathway affected in cancer. The main pathway involved in CRC is MAPK/ERK signaling pathway, which members are good targets for designing new specific inhibitors that could help to overcome the problems related to non-responsive patients to EGFR-targeted therapy. This thesis is focused on the relationship between the response to certain drugs and miRNA transcriptome changes in CRC human cellular models, based on KRAS mutational status. We profiled the expression of 667 miRNAs in 2 human CRC cell lines (Caco-2, KRAS wild type, and HCT-116, KRAS mutated), and 745 miRNAs in 3 CRC cell lines (Caco-2, HCT-116 and SW-620, another KRAS mutated cell line) after treatment with cetuximab and three specific inhibitors of MAPK pathway, respectively. Our aim was the identification of typical miRNA transcription profiles associated to cetuximab response, as well as the investigation on the global involvement of miRNAs within MAPK/ERK pathway. In the first analysis we identified substantially unique subsets of differentially expressed miRNAs in the sensitive cell line compared to the resistant one. Global network functional analysis on their targets suggested a role of these miRNAs in cancer related processes and identified hubs involved in EGFR internalization. In the second analysis we identified six differentially expressed miRNAs, that we have demonstrated to be involved in cell proliferation, migration, apoptosis, and to globally affect the regulation circuits centered on MAPK/ERK signaling. We evaluated the expression of the main candidate miRNAs identified in both studies in biopsies from CRC patients, previously categorized for their KRAS status: two miRNAs from the first study (miR-146b-3p and miR-486-5p) and four from the second (miR-92a-1*, miR-135b*, miR-372, miR-720) resulted highly expressed in biopsies from CRC patients than in normal controls. Moreover, the last four miRNAs are also overexpressed in CRC patients with mutated KRAS than in wild-type genotypes. The identification of miRNAs, which expression is linked to the efficacy of therapy, should help to predict the patients response to treatment and possibly lead to a better understanding of the molecular mechanisms of drug response. Our results contribute to deepen current knowledge on some features MAPK/ERK pathway, pinpointing new oncomiRs in CRC and allowing their translation into clinical practice and CRC therapy. Data shown in this thesis were published in 2010 and 2012 (Ragusa M, Majorana A, Statello L, et al. Specific alterations of microRNA transcriptome and global network structure in colorectal carcinoma after cetuximab treatment. Mol Cancer Ther. 2010 Dec; 9:3396-409; Ragusa M, Statello L, Maugeri M, et al. Specific alterations of the microRNA transcriptome and global network structure in colorectal cancer after treatment with MAPK/ERK inhibitors. J Mol Med (Berl). 2012 Jun 4).