Studio di nuovi approcci farmacologici in grado di inibire l'attivazione dei recettori del fattore di crescita epidermico (EGF) in linee cellulari di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC)

Genetic factors and environmental exposures can play a role in the onset of lung cancer, which is the leading cause of cancer death world-wide. Non-small cell lung cancer (NSCLC) is the most common type of lung cancer, making up about 75%-80% of all cases. Surgical resection is the principal therapeutic approach, it could be preceded and/or followed by chemotherapy and is used in early stage. Previous studies have shown that overexpression or constitutive activation of epidermal growth factor receptors is involved in the growth of human cancers. In this study we administrated a combination of cetuximab, a monoclonal antibody which binds to the EGFR and trastuzumab, a monoclonal antibody which binds to the HER-2. The two drugs were used at various concentrations and after 72 h of treatment we investigated the consequences of blocking both the receptors on A549 and NCI-H226 cell proliferation. MTT assay (3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide), showed the 91,4% of inhibition of A549 cell proliferation with 40 ug/ml of cetuximab and trastuzumab, while NCI-H226 cells were resistant to the same treatment. Successively we evaluated the possible variations of mRNA expression levels of EGFR and HER-2 in both cell lines. In A549 cells we observed a significant increase of mRNA levels after 30 h of treatment, explainable considering the mechanism of action of cetuximab, which determines the internalisation and degradation of receptor in a short time. A new receptor protein will then be synthesised. These mRNA levels decreased after 48 h and 72 h of treatment to reach the control levels. A similar behaviour was observed in HER-2 m-RNA levels, in which the internalisation of receptor, following the interaction with trastuzumab, determined an increase of this receptor expression already after 18h of treatment. As regards NCI-H226 cells, they showed an increase of three and a half times in EGFR mRNA levels after 48 h of treatment and the maintenance of high levels also after 72 h. HER-2 receptor seemed not to be influenced by pharmacological treatment and, at least during the first times of administrations, the mRNA levels were not changed. An increase of these levels were observed only after 72 h of treatment, when they were almost redoubled, to indicate a possible late involvement of this receptor in the response to the combined treatment. The early little involvement of the HER-2 receptor could be responsible of the resistance of the NCI-H226 cells to the treatment. Therefore, our future objective will be to treat NCI-H226 cells for longer times with cetuximab and trastuzumab to evaluate a more late antiproliferative effect. The difference of sensibility to cetuximab and trastuzumab in both cells line, did not depend instead on gene copy number, since, by fluorescent in situ hybridisation (FISH) technique, we observed the same increase of gene copy number of EGFR and of HER-2 and then a condition of polisomy, in both cell lines. The strategy to block both receptors could improve the treatment of lung cancer, increase the survival and reduce the negative side effect of therapy, improving quality of life in patients.

Il carcinoma del polmone rappresenta attualmente la neoplasia più frequentemente diagnosticata e costituisce la principale causa di morte per tumore solido al mondo. E' una malattia multifattoriale che riconosce nella cancerogenesi cause ambientali e cause genetiche. L'istotipo più frequente è il carcinoma non a piccole cellule (NSCLC) che rappresenta circa il 75-80% delle diagnosi. Il principale approccio terapeutico consiste nella resezione chirurgica (eventualmente preceduta e/o seguita da chemioterapia) limitata però ai soli stadi iniziali. Studi precedenti hanno dimostrato che l'iper-espressione o l'attivazione costitutiva dei recettori del fattore di crescita epidermico (EGF) è coinvolta nella crescita dei carcinomi umani, incluso quello polmonare. In questo lavoro sperimentale è stato studiato l'effetto del blocco di due recettori dell EGF, EGFR e HER-2, sulla proliferazione delle cellule A549 e NCI-H226 di carcinoma polmonare. Sono stati utilizzati, a tale scopo, cetuximab, anticorpo monoclonale diretto contro l'EGFR e trastuzumab, anticorpo monoclonale diretto contro l'HER-2, a diverse concentrazioni per 72 h. Mediante il saggio di proliferazione MTT (3,(4,5-dimethylthiazol-2)2,5 difeniltetrazolium bromide) è stato osservato il 91,4% di inibizione della proliferazione delle cellule A549 trattate con una combinazione di cetuximab e trastuzumab alla concentrazione di 40 ug/ml, mentre le cellule NCI-H226 hanno mostrato una resistenza allo stesso trattamento combinato. Sono state successivamente valutate le eventuali variazioni di espressione dei livelli di mRNA dei recettori EGFR e HER-2 di entrambe le linee cellulari. Nelle cellule A549 è stato osservato un significativo incremento dei livelli di mRNA di EGFR dopo 30 h dal trattamento farmacologico, spiegabile considerando il meccanismo di azione del cetuximab, che determina internalizzazione e degradazione del recettore in tempi brevi. A questa segue quindi nuova sintesi di proteine recettoriali. Questi livelli di mRNA diminuiscono dopo 48 h e 72 h dal trattamento per avvicinarsi poi ai valori normali. Un comportamento analogo è stato osservato nei livelli di mRNA del recettore HER-2, in cui l'internalizzazione del recettore, conseguente all'interazione con il trastuzumab, determina già a 18 h di trattamento un incremento dell espressione di tale recettore. Le cellule NCI-H226 hanno mostrato invece un aumento di circa 3,5 volte dei livelli di mRNA dell EGFR dopo 48 h dal trattamento e il mantenimento di alti livelli anche dopo 72 h. Il recettore HER-2 non sembra essere invece influenzato dal trattamento farmacologico e, almeno nei primi tempi della somministrazione, i livelli di mRNA non vengono alterati. Solo dopo 72 h di trattamento è stato osservato un aumento di tali livelli, che vengono circa raddoppiati, ad indicare un possibile coinvolgimento tardivo di tale recettore nella risposta al trattamento combinato. L'iniziale scarso coinvolgimento del recettore HER-2 potrebbe quindi essere responsabile della resistenza delle cellule NCI-H226. E pertanto nostro obiettivo futuro prolungare il tempo di trattamento delle cellule NCI-H226 con cetuximab e trastuzumab allo scopo di valutare un effetto antiproliferativo più tardivo. La differenza di sensibilità al cetuximab e al trastuzumab, nelle due linee cellulari prese in esame, non dipende invece dal numero di copie del gene, in quanto, mediante la tecnica di ibridazione in situ fluorescente (FISH), abbiamo osservato lo stesso incremento del numero di copie dei geni EGFR e HER-2 e quindi una condizione di polisomia, in entrambe le linee cellulari. La strategia di agire su entrambi i recettori potrebbe quindi migliorare il trattamento del carcinoma polmonare, aumentare la sopravvivenza e ridurre gli effetti collaterali della terapia, garantendo così al paziente un sensibile miglioramento della qualità di vita.