Investigation on donkey milk protein fractions: in vitro antimicrobial, antiviral and anti-proliferative activities and casein separation by cation exchange chromatography

This thesis was aimed to study donkey milk protein fractions and their biological properties. In the first Chapter the donkey¡¯s milk gross composition and the related hygienic-sanitary aspects are introduced. The main use of donkey milk in human nutrition, especially in infancy and in patients with cow milk protein allergy (CMPA), is also discussed. The second Chapter ¡°Antimicrobial compounds in milk¡± was drafted after an intensive course at the University of Copenhagen: ¡°Functional milk compound ¨C with focus on milk proteins¡±, and presented as the final report of the first year of PhD school. It deals with a review of the antimicrobial activity of milk components, with particular attention to whey proteins, as lactoferrin and lysozyme and their derived bioactive peptides, such as lactoferricin, which play a crucial role in human health and nutrition. The detailed description of the donkey whey proteins, which exhibit antimicrobial activity is presented in third chapter. Moreover, the antimicrobial activity of fresh, powdered, digested and fermented donkey milk has been discussed. The Fourth Chapter reports the studies on the antiviral activity of donkey milk and its fractions (skimmed milk, digested milk, casein, whey and low molecular weight whey fraction) that has been tested in vitro on an enterovirus, echovirus type 5, in two experimental trials. Among the others, we found that whey proteins showed the strongest inhibitory effects, probably thanks to the synergic actions of lactoferrin, lysozyme and lactoperoxidase. A preliminary investigation of anti-proliferative effect of skimmed donkey milk and its main protein fractions (casein and whey proteins), carried out through two assay performed in vitro on Human Neuroblastoma Cell Lines (SK-N-BE) is presented in the fifth Chapter. In our experimental conditions only the whey proteins, at the highest concentration, have shown anti-proliferative effect on cell growth. Finally, in the sixth Chapter, the preliminary results obtained from the analysis of the donkey¡¯s casein fraction by ion exchange chromatography, are described. By coupling chromatographic and mass spectrometry techniques, we obtained three different fractions from the separation of donkey¡¯s casein: pure ¦Â-casein, ¦Ás-caseins and a pool containing ¦Ê-casein and ¦Ás-caseins. The survey was carried out with the aim to obtain protein standards to use in quantification analysis.

L’obiettivo principale di questa tesi è stato quello di mettere in luce alcune attività biologiche del latte di asina, con particolare riguardo alle proprietà antimicrobiche, antivirali e anti-proliferative delle sue frazioni proteiche. Nel primo Capitolo si introduce il latte di asina e se ne descrivono la composizione ed i relativi aspetti igienico-sanitari. Inoltre, il suo utilizzo nell’alimentazione umana, specialmente nell’infanzia e nei pazienti con allergia al latte vaccino è brevemente discusso. Il secondo Capitolo raccoglie le informazioni acquisite durante un corso intensive seguito presso l’Università di Copenhagen su ¡°Functional milk compound ¨C with focus on milk proteins¡± e costituisce il report del primo anno di dottorato. Esso riporta un’accurata descrizione sull’attività antimicrobica del latte, con particolare attenzione alle proteine del siero, quali la lattoferrina e il lisozima ed ai peptidi bioattivi da esse derivati, come la lattoferricina, i quali svolgono un ruolo cruciale per la salute umana e la nutrizione. Il terzo capitolo presenta una dettagliata descrizione delle proteine del siero di latte di asina che hanno mostrato azione antimicrobica nel latte fresco, latte digerito con enzimi proteolitici, ma anche in polvere e fermentato. Il quarto Capitolo presenta gli studi sull'attività antivirale del latte di asina e le sue frazioni (latte scremato, latte digerito con enzimi gastro-intestinali umani, caseina, proteine del e proteine del siero a basso peso molecolare), che è stata testata in vitro su un tipo di enterovirus, echovirus 5, in due prove sperimentali. I risultati ottenuti hanno mostrato un forte effetto inibente sulla replicazione virale delle proteine del siero, probabilmente dovuta al sinergismo tra tra i suoi componenti. Lo studio sull’attività anti-proliferativa del latte di asina scremato e le sue frazioni proteiche (caseina e siero di latte), eseguito attraverso due prove sperimentali, in vitro, su Human Neuroblastoma Cell Lines (SK-N-BE), è presentato nel quinto Capitolo. Solo le proteine del siero alla più alta concentrazione hanno inibito la crescita cellulare. In fine, nel sesto Capitolo, sono riportati i risultati preliminari riguardanti l’analisi della frazione caseinica mediante cromatografia a scambio ionico. Grazie all’utilizzo combinato di tecniche di cromatografia e spettrometria di massa, sono state ottenute tre frazioni dalla separazione delle caseine del latte di asina: ¦Â-caseina pura, ¦Ás-caseine e un pool contenente ¦Ê-caseina e ¦Ás-caseine. Lo scopo della prova sperimentale era quello di ottenere standard proteici da utilizzare in successive analisi quantitative.