Study of fluoroquinolone resistance in Lactobacillus spp.

Aims of the study and results. 244 strains previously classified as Lactobacillus spp., isolated from women s vagina and belonging to the collection of Department of Bio-Medical Science section of Microbiology, University of Catania, have been characterized to the species level using a polyphasic approach. This approach provides both isolation on selective media, and the use of genotyping techniques: 16S-RFLP,two steps multiplex PCR and tuf gene species-specific primer for L. paracesei-L.rhamnusus discrimination. The susceptibility profiles for ciprofloxacin, levofloxacin, ofloxacin and ulifloxacin have been determined. In particular, we have studied the mechanisms of genotypic resistance of four strains of L. fermentum that showed reduced in vitro susceptibility or resistance to the fluoroquinolone ciprofloxacin (assuming as resistant strains with MIC greater than or equal to 4 mg/mL). The first hypothesized mechanism of resistance involves mutations in QRDR regions (Quinolone stance made Determining Regions) of the DNA gyrase and topoisomerase IV subunits genes. In order to identify these mutations, QRDR of the parC and gyrA genes were amplified. The sequencing results revealed the presence of nucleotide mutations, which, however, did not result in changes of the amino acid sequence. These results are consistent with those obtained by Fukaoo et all. in 2003. The quinolone resistance mechanisms mediated by efflux pumps MDR (Multi Drug Resistance) was also investigated. The trend of the intracellular concentrations of ciprofloxacin in an interval between zero and four hours has been measured; ciprofloxacin concentrations were analyzed by exploiting the values of maximum absorption at 275 nm which give rise to an emission peak at 447 nm. Further studies, conducted with phenotypic uncouples (CCC carbonyl-cianil-chlorophenyl hydrazone) and with MDR channel blockers (Verapamil and reserpine) have revealed a reduction of ciprofloxacin MIC values (2 fold reduction). The comparative genomic analysis performed on GenBank showed that in L. fermentum ATCC 14931 there are two hypothetical proteins: one (GenBank ref.ZP_03944345.1) belonging to the MFS (Major Facilitator Superfamily) family which has a homology of 98% with Nora (GenBank ref.CCE58495.1), the protein responsible for quinolones efflux in S. aureus; the other one (GenBank ref.ZP_03944509.1) belonging to the ABC (ATP Binding Cassette) family, which has a sequence homology of 90% with LmrA (GenBank ref.YP_005868060.1) responsible for quinolones efflux in L. lactis.

Obiettivi della ricerca e risultati. 244 ceppi in precedenza classificati come Lactobacillus spp., di origine vaginale e appartenenti alla batterioteca del Dipartimento di Scienze Bio-Mediche sez. Microbiologia dell'Università degli studi di Catania, sono stati caratterizzati a livello di specie mediante un approccio di tipo polifasico. Tale approccio prevede sia l'isolamento su terreni selettivi, sia l'uso di tecniche genotipiche:16S-RFLP, two steps multiplex PCR e tuf gene PCR per la discriminazione di L. paracasei-L.rhamnosus. Sono stati determinati i profili di sensibilità per quattro fluoroquinoloni: ciprofloxacina, levofloxacina, ofloxacina e ulifloxacina. In particolare, sono stati studiati i meccanismi di resistenza genotipica di quattro ceppi di L. fermentum che hanno mostrato ridotta sensibilità in vitro o resistenza verso ciprofloxacina (assumendo come resistenti, i ceppi con MIC maggiore o uguale a 4 µg/mL). Il primo meccanismo di resistenza ipotizzato coinvolge le mutazioni presenti a livello delle regioni QRDR(Quinolone Resistance Determining Regions) dei geni delle subunità della DNA girasi e della topoisomerasi IV , per individuare tali mutazioni sono state amplificate le QRDR dei geni parC e gyrA, delle rispettive subunità della Topoisomerasi IV e della DNA girasi, bersagli farmacologici dei chinoloni. I risultati del sequenziamento hanno evidenziato la presenza di mutazioni nucleotidiche, che però non hanno determinato variazioni nella sequenza aminoacidica. Tale risultato è in linea con quanto descritto nel 2003. da Fukaoo et al., i quali hanno dimostrato l'assenza di modificazioni a carico dei geni gyrA e parC , quindi lo studio si è orientato alla ricerca di meccanismi di efflusso mediate da pompe MDR (Multi Drug Resistance). A tal fine è stato misurato l'andamento delle concentrazioni intracellulari in un intervallo di tempo compreso tra zero e quattro ore; la variazione delle concentrazioni di ciprofloxacina è stata analizzata sfruttando i valori di assorbimento massimo a 275 nm da cui scaturisce un picco di emissione a 447 nm. Lo studio fenotipico condotto sia con disaccoppianti (CCC carbonil-cianil-clorofenil idrazone), sia con bloccanti dei canali tipo MDR (Verapamil e reserpina), hanno rivelato una riduzione dei valori di MIC per ciprofloxacina (riduzione di due diluizioni). L'analisi genomica comparata condotta su GenBank ha mostrato che in L. fermentum ATCC 14931 sono presenti due proteine ipotetiche: una (GenBank ref.ZP_03944345.1) appartenente alla famiglia MFS (Major Facilitator Superfamily) che presenta un omologia del 98% con NorA (GenBank ref.CCE58495.1) proteina responsabile dell'efflusso dei chinoloni in S. aureus; un altra (GenBank ref.ZP_03944509.1), appartenente alla famiglia ABC, che presenta una omologia del 90% con LmrA (GenBank ref.YP_005868060.1) responsabile dell'efflusso dei chinoloni in L. lactis.