Multiple gene contribution to the phenotypic and genotypic Daptomycin non-susceptible (DNS) variants of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus isogenic strains

Daptomycin (DAP) represents today a valid alternative choice in the treatment of multi-drug resistant (MDR) Staphylococcus aureus infections that do not respond to vancomycin therapy. Knowledge of clinical failure associated with DAP non-susceptibility (DNS) have been accounted in the USA and Europe, and the possibility of glycopeptide induction of low levels of DAP efficacy is worsening this scenario. The phenotypic alterations that characterize DNS S.aureus take place in changes in cell-wall arrangement, turnover, membrane structure and potential, and in modifications of cell autolysis and permeabilization. This study intended to analyze the molecular traits responsible for the phenotypic features of DNS strains, in three sets of isogenic clinical S.aureus in which DNS phenotype arise after DAP therapy. With regard to the genes involved in cell-wall charge, quantitative relative real time RT-PCR data revealed that mprF showed an up-regulation in DNS strains presenting a mprF mutation, whereas a down-regulation in DNS strains which not presented mutations. All DNS isolates had a dltA up-regulation, while both DNS and hDAP strains presented a cls2 up-regulation. Considering genes involved in the cell-wall turnover and autolysis, all DNS isolates exhibited high transcription levels of sceD and atl. Our data confirm the multi-factorial nature of DNS and suggest that the keystone of this phenotype is the mechanism of electrostatic repulsion and, indirectly, a reduction of autolysin activity due mainly to a dltA over expression-dependent, cls2-independent mechanism, as well as to the accumulation of additional secondary factors, such as the presence of mutations correlated with the increased levels of mprF transcription.

Daptomicina (DAP), un lipopeptide ciclico, costituisce ad oggi una valida alternativa per il trattamento delle infezioni da Staphylococcus aureus multi-resistente (MDR) che non rispondono alla terapia con vancomicina. Case reports di fallimenti terapeutici associati a ridotta sensibilità a DAP sono stati riportati sia negli USA ed in Europa, inoltre, la possibilità che l esposizione ai glicopeptidi possa condizionare l efficacia del trattamento con DAP aggrava tale scenario. I cambiamenti fenotipici alla base della ridotta sensibilità a DAP (DNS) possono riguardare alterazioni del cell-wall, del turnover, del potenziale di membrana, modificazioni dell attività autolitica e della permeabilità cellulare. Obiettivo di questo lavoro è stato quello di analizzare i tratti molecolari responsabili delle caratteristiche fenotipiche della DNS in tre gruppi di ceppi clinici isogenici di S.aureus nei isolati dopo terapia con DAP. Per quanto riguarda i geni coinvolti nelle cariche di parete, i dati di real time RT-PCR hanno rivelato una up-regolazione di mprF nei ceppi DNS che presentavano mutazioni in tale gene, mentre una down-regolazione nei ceppi DNS che non presentavano tali mutazioni. Tutti i ceppi DNS presentavano una up-regolazione dei trascritti di dltA, inoltre sia gli isolati DNS che hDAP mostravano una up-regolazione di cls2. Considerando invece i geni coinvolti nel turnover del cell-wall e nell autolisi, tutti i ceppi DNS esibivano elevati livelli di trascrizione di sceD e atl. In conclusione, i nostri dati suggeriscono la multi-fattorialità del meccanismo di ridotta sensibilità a DAP e ci permettono di proporre come caratteristica principale di tale fenotipo un meccanismo di repulsione elettrostatica e, indirettamente una riduzione dell'autolisi, dltA-dipendente cls2-indipendente, ma anche all'accumulo di fattori secondari aggiuntivi come la presenza di mutazioni correlate con gli alti livelli di trascrizione di mprF.