Localizzazione intranucleare ed espressione del gene HLXB9 nel differenziamento neuronale in vitro e nell insorgenza di disordini mielodi

Chromosomes show a nuclear radial distribution according to the GC-level/gene-density, and this type of chromatin organization is related to the transcriptional status of the corresponding DNA sequences. Alteration of chromatin organization, also in response to environmental pollutants, can lead to gene repositioning in the nucleus, causing various diseases such as cancer. Moreover chromatin reorganization is a key event during cellular differentiation process, which includes over-expression or down-regulation of several genes that allow the cell to obtain specific characteristics. The aim of PhD work was the chromatin reorganization in tumor cells and during cell differentiation. In particular, has been given attention to HLXB9 gene that changes its intranuclear position in several cases of infant acute myeloid leukemia. The gene is located on chromosome 7q36.3. It is inactive in lymphocytes after embryonic development but is expressed, as well as in patients with acute myeloid leukemia with translocation 7;12, in GDM-1 cell line, derived from a patient with myeloproliferative disorder. It is a gene involved in motor neurons and pancreatic beta cells differentiation and it has pathological implications in Currarino Syndrome. In this work HLXB9 was analyzed in normal lymphocytes and leukemic cells, and moreover, in SK-N-BE cells that, with retinoic acid, differentiate into neuronal cells. In lymphocytes obtained from peripheral blood of patients with myeloid disorders and in the GDM-1 cell line, that has an activated HLXB9, was demonstrated gene intranuclear relocalization in a more internal nuclear region, where it is actively transcribed. In GDM-1 cell line has been shown that translocation 6;7 does not determine an intranuclear repositioning of HLXB9 allele involved in the rearrangement. It was observed, with appropriate combinations of fluorescent probes used in in situ hybridizations on interphase nuclei, the relocation of the wild-type allele in a more internal and atypical nuclear region, compared to normal lymphocytes. This relocation could be the cause of HLXB9 gene over-expression in the cell line GDM-1. Also, lymphocytes cultured with phytohemagglutinin for three days, returning blasts with an active proliferation, have a reactivation of the HLXB9 gene. This leads to the hypothesis that over-expression of HLXB9 in leukaemic cell line GDM-1 could be caused by a mechanism similar to that involved in activation induced by phytohemagglutinin. Neuroblastoma SK-N-BE cells, proliferative and differentiated by retinoic acid, showed an intranuclear repositioning of the HLXB9 gene during differentiation which has been associated with its expression levels. Results obtain in SK-N-BE cells indicate that it may be used as a specific marker of the initial stages of neuronal cell differentiation. A reactivation of the HLXB9 gene was also observed in SK-N-BE cells induced in apoptosis with Staurosporine. It could induce cell differentiation processes, but, after few hours of treatment, cells don t differentiate into mature neurons and acquire the typical morphology of apoptotic cells. Finally, the data of HLXB9 intranuclear localization obtained on non-human primates lymphoblastoid cell lines indicate that the gene has maintained its localization on chromosomal level, remaining on the telomere of chromosome 7, and a constant position to the nuclear periphery. Indirectly this highlights that the function of HB9 protein, encoded by HLXB9 gene, is evolutionarily conserved.

I cromosomi mostrano una distribuzione radiale nel nucleo in accordo con il loro livello di GC e con la densità genica. Questo tipo di organizzazione cromatinica è correlata allo stato trascrizionale delle sequenze di DNA corrispondenti. Un alterazione dell organizzazione della cromatina, anche in risposta ad inquinanti ambientali, può determinare un riposizionamento genico a livello nucleare causando patologie varie come quelle tumorali. Inoltre la riorganizzazione della cromatina è un evento fondamentale durante il processo di differenziamento cellulare che prevede l overespressione o la down-regolazione di diversi geni che permettono alla cellula di assumere le caratteristiche specifiche. La tematica affrontata durante il Dottorato di ricerca è stata la riorganizzazione della cromatina in cellule tumorali e durante il differenziamento cellulare. L attenzione è stata rivolta al gene HLXB9 che modifica la sua posizione intranucleare in diversi casi di leucemia mieloide acuta infantile. Esso è localizzato sul cromosoma 7q36.3. È inattivo nei linfociti dopo lo sviluppo embrionale ma è espresso, oltre che in pazienti affetti da leucemia mieloide acuta con t(7;12), nella linea cellulare GDM-1, derivata dal sangue periferico di una paziente con un disordine mieloproliferativo. È un gene coinvolto nel differenziamento dei motoneuroni e delle cellule beta pancreatiche con risvolti patologici, come nella Sindrome di Currarino. In questo lavoro HLXB9 è stato analizzato in linfociti normali e in cellule leucemiche, ed inoltre, in cellule SK-N-BE differenziate in cellule neuronali. Nei linfociti ottenuti dal sangue periferico di pazienti con disordini mieloidi e nella linea cellulare GDM-1, che possiede un attivazione di HLXB9, è stata dimostrata una rilocalizzazione intranucleare del gene in un compartimento più interno del nucleo, dove viene attivamente trascritto. Nella linea cellulare GDM-1, nonostante la presenza di una traslocazione che coinvolge il chr 7, non vi è un riposizionamento intranucleare dell allele di HLXB9 coinvolto nel riarrangiamento, bensì dell allele wild-type che si troverà riposizionato in un compartimento più interno del nucleo.Questa rilocalizzazione potrebbe essere la causa dell overespressione del gene HLXB9 nella linea cellulare GDM-1. Inoltre i linfociti posti in coltura con fitoemagglutinina per tre giorni, ritornando blasti con un attiva proliferazione, presentano una riattivazione del gene HLXB9. Questo fa ipotizzare che l overespressione di HLXB9 nella linea cellulare leucemica GDM-1 possa essere dovuta ad un meccanismo simile a quello coinvolto nell attivazione indotta da PHA. Cellule di neuroblastoma SK-N-BE, proliferative e in fase di differenziamento indotto da acido retinoico, hanno evidenziato un riposizionamento intranucleare del gene HLXB9 durante il differenziamento che è stato inoltre associato con il livello della sua espressione. Le osservazioni sul comportamento di HLXB9 nelle cellule SK-N-BE indicano che esso può essere utilizzato come un marker specifico degli stadi iniziali del differenziamento delle cellule nervose, da utilizzare insieme ad altri marcatori che caratterizzano però la cellula neuronale matura. Una riattivazione del gene HLXB9 è stata anche osservata nelle cellule SK-N-BE indotte in apoptosi con Staurosporina. Essa potrebbe indurre processi di differenziamento cellulare, ma dopo poche ore dal trattamento, le cellule, anziché differenziare in neuroni maturi acquisiscono la tipica morfologia delle cellule apoptotiche. Infine i dati di localizzazione intranucleare di HLXB9 ottenuti sulle linee linfoblastoidi di Primati non umani ci indicano che il gene ha mantenuto la sua localizzazione sia a livello cromosomico, mantenendosi sul telomero del chr 7, sia a livello intranucleare mantenendo una posizione costante alla periferia del nucleo. Questo evidenzia indirettamente come anche la funzione della proteina HB9 codificata da HLXB9 sia evolutivamente conservata.