Analysis of the involvement of exosomal miRNAs and proteins in the response of CRC cells to Cetuximab

It has been demonstrated that intercellular communication via cell- released vesicles is very important both for normal and tumor cells, and specifically to determine tumor development and progression as well as invasion and angiogenesis. Cell communication could involve the exosomes, small vescicles of endocytic origin, which are released from different kinds of donor cells; they can transfer molecular signals as proteins and RNAs through the extracellular environment to specific recipient cells in a autocrine, paracrine or endocrine way. Exosomes can strongly influence the recipient cells phenotype by transferring oncogenes that could influence the response of cells to drugs or immune reactions. Recently, it has been demonstrated the presence of miRNAs inside the exosomes and their potential involvement in cancer development. Considering the important role of miRNAs in colorectal cancer, one of the most diffused and studied tumor, it was considered interesting to investigate the role of exosomal miRNAs and associated proteins in the response of CRC cells to Cetuximab (an anti-EGFR therapeutic antibody). The EGFR signaling pathway is very importantly in relationship both to CRC and miRNA biogenesis and expression, and recently also to the exosomal communication system. Therefore, one of the major aims of this thesis was to analyze the possible involvement of exosomes in the response to Cetuximab of two CRC cell lines (wild-type KRAS Caco-2 cells and KRAS mutated HCT-116 cells) through the transfer of specific miRNAs and proteins to recipient cells. To carry out this analysis, we performed cellular and exosomal miRNA profiling after Cetuximab treatment, for 745 miRNAs by using Real-Time PCR. The results of the analysis showed that exosomal miRNA profiles globally reflect those of whole cells at steady-state, but there exists an important quantitative asymmetrical distribution. After Cetuximab treatment, Caco-2 sensitive cells showed several exosomal differentially expressed (DE) miRNAs in comparison to HCT-116 cells. Many DE miRNAs are involved in cancer and immunity. These data could be explained by considering that the EGFR pathway can regulate miRNA biogenesis via the MAPK/ERK cascade. Exosomal proteins analysis was performed for 741 cancer-related proteins through a specific antibody microarrays platform. Also the profile of exosomal proteins from Caco-2 cells showed important alterations after Cetuximab treatment. Globally, several DE miRNAs and proteins from Caco-2 exosomes were related to cancer, stimulation of immunity and inflammation. Interestingly, exosomes transfection experiments between Caco-2 and HCT-116 cell lines (performed to investigate their effect on cell viability) showed that the transfection of steady state Caco-2 exosomes in the HCT-116 cell line determined a decrease of cell viability of recipient cells, while Cetuximab-treated Caco-2 cells exosomes, transfected in HCT-116 cells, increased their viability. These data could be explained considering that exosomes from Cetuximab-treated cells are enriched in oncogenic- and immune stimulation-related miRNAs. Finally, DE proteins were searched to find potential RNA-binding proteins. Globally, the results of this thesis could be useful to: (1) verify the existence of horizontal transfer of genetic informations in eukaryotes; (2) search for potential miRNAs and proteins biomarkers of Cetuximab response in CRC in vivo. Eventually, it will be interesting to perform the characterization of exosomal miRNAs and proteins expression profiles of plasma from CRC patients after Cetuximab treatment. Moreover, the characterization of the asymmetrical distribution of miRNAs between cells and exosomes could be important to further investigate the potential and specific mechanism of miRNA sorting within exosomes.

Recentemente è stata dimostrata l’importanza della comunicazione intercellulare attraverso vescicole rilasciate dalle cellule sia a livello fisiologico sia a livello dello sviluppo e della progressione dei tumori, compresi l’angiogenesi ed i processi metastatici. La comunicazione cellulare può coinvolgere gli esosomi, piccole vescicole di origine endocitica rilasciate da diversi tipi di cellule donatrici; gli esosomi possono trasferire dalle cellule donatrici a quelle riceventi segnali molecolari come RNA e proteine attraverso l’ambiente extracellulare in modo paracrino, autocrino e endocrino. Gli esosomi possono veicolare oncogeni che a loro volta possono influenzare la risposta farmacologica ed immune delle cellule riceventi. Considerando il ruolo cruciale dei microRNAs nel cancro al colon, uno dei tumori più diffusi al mondo, è stato reputato interessante investigare circa il ruolo dei microRNAs e delle proteine esosomali nella risposta di cellule di cancro al colon trattate dopo trattamento con cetuximab, un farmaco anti-tumorale diretto contro il recettore EGFR. In particolare, la via di EGFR è stata accostata alla biogenesi dei microRNAs e in aggiunta alla comunicazione intercellulare. Le due linee cellulari analizzate erano le Caco-2 (aventi il gene KRAS normale) e le HCT-116 (con il gene KRAS mutato). Per effettuare tale studio, è stata utilizzata la tecnologia della Real-Time PCR che ha consentito di verificare l’espressione di 745 microRNAs. I risultati hanno mostrato che il profilo di espressione dei microRNAs cellulari ed esosomali sono sovrapponibili, tuttavia esistono delle differenze quantitative, quindi una distribuzione quantitativa ed asimmetrica. Dopo il trattamento, le Caco-2 hanno mostrato una più forte risposta rispetto alle HCT-116. Molti microRNAs differenzialmente espressi negli esosomi delle Caco-2 trattate risultavano coinvolti nel cancro e nell’immunità. Tali dati potrebbero essere spiegati considerando che la via di EGFR, ed in particolare la cascata delle MAPK, possono controllare la biogenesi dei microRNAs. Per quanto riguarda l’analisi delle proteine esosomali, l’uso della tecnologia degli antibodies microarray, che ha consentito il profiling di 741 proteine cancer-related, ha evidenziato, in accordo coi i dati sui microRNAS, una maggiore risposta da parte delle Caco-2, nei cui esosomi post-trattamento si osservavano 59 proteine differenzialmente espresse contro le 9 delle HCT-116. Globalmente i microRNAs e le proteine esosomali differenzialmente espresse erano coinvolte nel cancro, nella stimolazione della risposta immune e quindi nell’infiammazione. Inoltre, la trasfezione di esosomi isolati dalle Caco-2 a steady-state (non trattate) in cellule di HCT-116 determinava la diminuzione della proliferazione cellulare delle stesse HCT-116, al contrario gli esosomi derivati da Caco-2 trattate con cetuximab trasfettati in HCT-116 causavano un aumento della loro proliferazione cellulare. Gli esosomi delle cellule trattate potrebbero contenere oncogeni e microRNAs coinvolti nella stimolazione del sistema immune. Per approfondire l’analisi proteica, le proteine esosomali differenzialmente espresse dopo trattamento sono state analizzate per individuare eventuali proteine capaci di legare l RNA. Ciò potrebbe essere utile per investigare circa il sorting dei microRNAs all’interno degli esosomi, processo ancora inesplorato e non caratterizzato. Globalmente i risultati della tesi potrebbero essere utili al fine di: 1) approfondire i meccanismi di trasferimento orizzonatale tra le cellule eucariotiche, tramite gli esosomi; 2) permettere la ricerca di biomarcatori (microRNAs e proteine), della risposta al cetuximab in vivo. Da questo punto di vista, sarebbe interessante caratterizzare il profilo di espressione dei microRNAs e delle proteine degli esosomi derivati dal plasma di pazienti affetti da cancro al colon dopo la somministrazione del cetuximab.