Identificazione di nuovi target molecolari per la terapia del carcinoma poco differenziato della tiroide: studi in vitro

Background. Poorly differentiated thyroid carcinomas are refractory to conventional treatments. In the last few years, several studies have been conducted in order to identified the molecular alterations that often are present in these tumors and that may be responsible for the lack of effectiveness of classical anti-cancer therapies. The EGF receptor (EGFR) tyrosine kinase and IGF-IR represent newly attractive targets because these receptors are overexpressed in the majority of poorly differentiated thyroid carcinoma. In the last years, pharmaceutical companies have synthesized various inhibitors including Gefitinib and NVP-AEW541, which specifically inhibit the tyrosine kinase activity of EGFR and IGF-IR, respectively. However, the preclinical studies conducted until now have been disappointing because cancer cells may develop resistance to these drugs. Objective. Using a panel of different thyroid cancer cells, we aimed to evaluate the possible molecular mechanisms involved in the resistance to the pharmacological blockade of EGFR and IGF-IR by Gefitinib and NVP-AEW541, respectively. Results 1 (EGFR blockade): Using western blot analysis, we found that EGFR was overexpressed in all human thyroid cancer cell lines analyzed. EGFR inhibition, using Gefitinib, effectively inhibited EGFR phosphorylation. Unexpectedly, the drug was poorly effective in reducing cell viability as well as in inhibiting the ERK phosphorylation in all cell lines analyzed, with the exception of the WRO and HTH-74 cells. The poor response to Gefitinib was associated with genetic alterations, leading to constitutive activation of the ERK pathway, including BRAF(V600E) or HRAS(G12A/Q61R) mutations or RET/PTC1 rearrangement. Indeed, when BRAF(V600E)-positive thyroid cancer cells were incubated with the specific BRAF inhibitor, PLX4032, the sensitivity to Gefitinib was restored. Similar results were obtained with specific RET inhibitors. Results 2 (IGF-IR inhibition): We evaluated the anti-proliferative effects of NVP-AEW541 in a panel of cells derived from poorly differentiated thyroid carcinoma (ATC) and selected both sensitive and resistant cell lines. In all cells analyzed, NVP-AEW541 inhibited IGF-IR phosphorylation. In sensitive cells, NVP-AEW541 exerted anti-proliferative effects and inhibited AKT phosphorylation (pAKT), while ERK phosphorylation was marginally affected. In resistant ATC cells, NVP-AEW541 was less effective in inhibiting pAKT while ERK phosphorylation remarkably increased. In FF1 cells showing, at protein level, high IR:IGF-IR ratio, we found that EGF receptor (EGFR) was also activated by NVP-AEW541 and, together with IR, was responsible of ERK activation. This result was absent in C643 cells, which express high IGF-IR and low IR protein levels. Therefore, we evaluated the effectiveness of a combination treatment with EGFR or MAPK inhibitors. We found that the co-treatment of NVP-AEW541 with Gefitinib or specific ERK inhibitors was able to partially revert the resistance to IGF-IR blockade alone. Conclusions. Overall, these results indicate that BRAF(V600E) by activating the ERK pathway may play a major role in determining Gefitinib resistance in all thyroid cancer cells harboring this mutation. Furthermore, high IR and EGFR expression may both contribute to resistance to IGF-IR inhibition in human ATC cells. In summary, a combination therapy with other molecular targeted drugs, such as MAPK or EGFR inhibitors, may overcome these mechanisms of drug resistance.

Premessa. I carcinomi poco differenziati della tiroide sono refrattari ai trattamenti convenzionali per cui negli ultimi anni si sono condotti diversi studi finalizzati ad identificare le alterazioni molecolari di più frequente riscontro e che potrebbero essere responsabili della scarsa efficacia delle terapie classiche. Bersagli molecolari interessanti sono: il recettore per l EGF e quello per l IGF-I poiché entrambi iperespressi nel carcinoma tiroideo. Di recente, le case farmaceutiche hanno sintetizzato vari inibitori molecolari rivolti verso entrambi i recettori, per esempio il Gefitinib inibitore di EGFR e l NVP in grado di bloccare IGF-IR. Tuttavia, gli studi preclinici condotti finora hanno dato risultati poco soddisfacenti, in termini di efficacia antitumorale, per la possibile insorgenza di meccanismi di resistenza. Oggetto dello studio. In questo studio, su una serie di linee cellulari di carcinoma tiroideo, abbiamo valutato i meccanismi molecolari di resistenza al blocco farmacologico di EGFR ed IGF-IR, usando come inibitori il Gefitinib e l NVP. Risultati 1 (Inibizione di EGFR): Valutando l espressione di EGFR, mediante western blot, è stato visto che le linee di carcinoma tiroideo analizzate iper-esprimevano tale recettore e che il Gefitinib era in grado di inibire la sua fosforilazione. Contrariamente, questo farmaco si è mostrato scarsamente efficace nella riduzione della proliferazione delle cellule neoplastiche e della fosforilazione di ERK, mediatore a valle di EGFR. Questo dato è stato ottenuto nella maggior parte delle linee cellulari testate, ad eccezione delle linee WRO e Hth-74 che sono risultate sensibili al farmaco. Il Gefitinib non è risultato efficace in tutte quelle linee cellulari recanti mutazioni dei geni che portano all'attivazione costitutiva della via di ERK, tra cui BRAF (V600E), HRAS (G12A/Q61R) o riarrangiamento RET/PTC1. Alla luce di ciò, in questo studio abbiamo valutato gli effetti dell'inibizione dell'oncogene BRAF(V600E) e di RET sulla sensibilità delle cellule di carcinoma tiroideo al Gefitinib. Abbiamo trovato che l'inibizione di BRAF, mediante l'inibitore selettivo PLX4230, ripristina gli effetti del Gefitinib in tutte le cellule in possesso della mutazione del BRAF. Risultati simili sono stati ottenuti con inibitori di RET. Risultati 2 (Inibizione di IGF-IR): Dopo aver valutato gli effetti antiproliferativi dell NVP-AEW541 in un gruppo di linee cellulari tumorali tiroidee abbiamo selezionato linee sensibili e resistenti. In tutte le linee, sia sensibili che resistenti, l NVP ha inibito la fosforilazione di IGF-IR. Nelle cellule sensibili, l'NVP ha esercitato effetti antiproliferativi ed è stato in grado di inibire la via di segnale dipendente da AKT (pAKT) in maniera più efficace rispetto alla via di ERK1/2. Viceversa, nelle linee resistenti si è osservato un aumento di attivazione di ERK1/2 dopo NVP e nessuna inibizione di pAKT. Nelle FF1 aventi un alto rapporto IR:IGF-IR, abbiamo trovato che EGFR viene attivato in seguito al trattamento con NVP. Questo dato non è stato riscontrato nelle C643, le quali esprimono alti livelli di IGF-IR e bassi livelli di IR. Pertanto, abbiamo valutato l'efficacia di un trattamento combinato volto ad inibire sia IGF-IR che EGFR o le vie a valle di esso quali MAPK. Abbiamo trovato che l inibizione di IGFIR associata a quella di EGFR o di ERK, è in grado di superare i meccanismi di resistenza all'inibizione singola di IGF-IR. Conclusioni. Questi risultati indicano che in alcune linee di carcinoma tiroideo la resistenza al Gefitinib è dovuta principalmente alla mutazione del BRAF(V600E) e che tale resistenza può essere superata utilizzando il Gefitinib in combinazione con inibitori del BRAF. Inoltre, l'iperespressione di IR e di EGFR possono entrambi contribuire alla resistenza dell'inibizione di IGF-IR. Una terapia combinata con altri farmaci molecolari mirati, come inibitori di EGFR o MAPK potrebbero superare questi meccanismi di resistenza.