Formazione di proteine canale: dal mitocondrio a SARS-CoV-2. Caratterizzazione funzionale e strutturale attraverso l'uso di tecniche respirometriche e di dinamica molecolare

Proteins are macromolecules consisting of up thousands of amino acids units linked by peptide bonds to form variously folded chains whose three-dimensional structure is closely related to the biological function they perform. Depending on their functionality, proteins can be classified into different groups, including enzymes, transport proteins, structural proteins, defence proteins and regulatory proteins. Depending on their selectivity, transport proteins can be divided into porins and ion channels. However, the study of such proteins is of particular interest because they facilitate the passage from one cellular environment to another and regulate various cellular processes. Among the most important known porins is VDAC (Voltage Dependent Anion Channel), whose functions include the transport of many molecules, including ions and various metabolites and compounds involved in neurodegenerative processes, such as α-synuclein aggregates, the main constituents of Lewy bodies. This thesis will investigate the role that VDAC1 may play in the regulation of mitochondrial respiratory functions usinng specific respirometry techniques. Similarly, the role of α-synuclein aggregates and the MPP+ toxin, both of which are implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease, will also be analysed. In all the work reported here, the different respiratory states have been evaluated, as a function of specific stimuli applied, in order to assess the response of the respiratory chain but more generally the variation in cellular functions. In the second part of this thesis, an ion channel will be characterised both structurally and functionally. This is the envelope protein, one of the major structural proteins of the SARS-CoV-2 virus. This protein, which is initially translated in monomeric form, tends to oligomerise to form a pentamer, with a pore at the centre of structure, which favours the transport of ionic currents. In order to understand the exact function of this pore, molecular dynamics simulations, docking predictions and electrophysiological experiments were carried out using the Planar Lipid Bilayer technique. The results obtained have made it possible to highlight a possible structural distribution capable of justifying the ionic activity of the channel, but above all the mechanism of ionic flux regulation due mainly due to the binding of calcium ions along the structure of the E2 protein itself.

Le proteine sono macromolecole formate anche da migliaia di unità di amminoacidi unite fra lor per mezzo di legami peptidici, in modo da formare catene variamente ripiegate la cui struttura tridimensionale è in stretta relazione con la funzione biologica svolta; in funzione della loro funzionalità le proteine possono essere distinte in diversi gruppi, tra i quali gli enzimi, le proteine di trasporto, le proteine strutturali, le proteine di difesa e le proteine regolatrici. In funzione della loro selettività, le proteine di trasporto possono essere distinte in porine, canali ionici. A prescindere lo studio di tali proteine è di particolare interesse perché favoriscono il passaggio da un ambiente cellulare all’altro, regolando i vari processi cellulari. Tra le principali porine riconosciute, vi è VDAC (Voltage Dependent Anion Channel), che tra le sue funzioni ha il trasporto di numerose molecole, tra cui ioni e metaboliti vari, tra cui composti vari coinvolti nei processi neurodegenerativi, come gli aggregati di α-sinucleina, principali costituenti dei corpi di Lewy. In questo lavoro di tesi, viene approfondito il ruolo che VDAC1 può avere nella regolazione delle funzioni di respirazione mitocondriale, attraverso specifiche tecniche di respirometria. In maniera analoga verrà analizzato anche il ruolo degli aggregati di α-sinucleina e della tossina MPP+, entrambe coinvolte nell’insorgenza del morbo di Parkinson. In tutti i lavori qui riportati sono stati valutati i vari stati di respirazione, in funzione di specifici stimoli applicati, in modo da valutare la risposta della catena respiratoria ma più in generale la variazione delle funzioni cellulari. Nella seconda parte di questo lavoro di tesi, invece verrà caratterizzata un canale ionico sia dal punto di vista strutturale che da quello funzionale. Si tratta della envelope protein, una delle principali proteine strutturali derivanti dal virus SARS-CoV-2. Tale proteina, inizialmente tradotta in forma monomerica, tende ad oligomerizzare formando un pentamero, al cui centro della struttura è presente un poro che favorisce il trasporto di corrente ionica. Ai fini di comprendere l’esatta funzione di questo poro sono state eseguite delle simulazioni di dinamica molecolare, delle predizioni di docking e sono stati effettuati degli esperimenti di elettrofisiologia, attraverso l’applicazione della tecnica Planar Lipid Bilayer. I risultati ottenuti hanno permesso di evidenziare una possibile distribuzione strutturale in grado di giustificare l’attività ionica del canale, ma soprattutto il meccanismo di regolazione di flusso ionico dovuto principalmente al legame di ioni calcio proprio lungo la struttura della stessa proteina E2.