Interazioni di Pseudomonas nel microbioma vegetale e ruolo nel biocontrollo di Plenodomus tracheiphilus agente causale del Mal secco degli agrumi

Mal secco disease (MSD) is a severe citrus tracheomycosis caused by the mitosporic fungus Plenodomus tracheiphilus (Pt). In this study we examined the effect of MSD infection on root (rhizosphere and endorhizosphere) and xylem endosphere microbial communities of Citrus aurantium (sour orange) seedlings following leaf- and root- inoculation with Pt through a metagenomic analysis based on 16S rDNA and ITS amplicons sequencing. The pathogen was detected by real-time PCR in the roots of root-inoculated plants and in the xylem of both leaf- and root-inoculated plants. Our results suggest that leaf and root infection with Pt alters the bacterial and fungal community composition of the compartments analyzed through a decrease or increase in the abundance of some key taxa. The genus Pseudomonas, which includes strains with known biocontrol activity, was the first taxon represented in the rhizosphere and the second in the endorhizosphere of both inoculated and uninoculated plants. According to differential abundance analysis, bacterial populations of this genus were significantly reduced in the roots of seedlings inoculated with the pathogen. The analysis of co-occurrence networks also suggested, overall, a change in the structure of microbial communities following infection with Pt. The P. corrugata subclade (P. corrugata, P. mediterranea, P. brassicacearum, P. thivervalensis, P. kilonensis) has plant growth promotion and biocontrol activities against various phytopathogens. A collection of P. corrugata and P. mediterranea strains from the Phytobacteriology laboratory (Di3A) was screened in vitro for biocontrol activity against different isolates of P. tracheiphilus. All bacterial strains tested showed in vitro antagonistic activity, albeit to varying degrees. The two most effective biocontrol strains in vitro, P. corrugata PVCT 4.3t and P. mediterranea PVCT 3C, were selected for further in vivo antagonistic assays and whole genome sequencing (WGS). Both strains significantly reduced the incidence and severity of MSD in lemon and sour orange plants especially in the early stages of infection. To investigate genes potentially involved in biocontrol activity, total genomic DNA from both strains was extracted and sequenced using the Illumina NovaSeq PE150 platform. Based on sequencing output, the genomes of P. corrugata PVCT 4.3t and P. mediterranea PVCT 3C harbor numerous biosynthetic gene clusters mainly coding for non-ribosomal peptide synthetases (NRPS) involved in the production of antimicrobial compounds. Collectively, these results indicate that the two selected strains are effective biological control agents against P. tracheiphilus both in vitro and in vivo. Based on the results obtained from genome analysis, we also studied the biological role of two genes (crmA, solR), never investigated before, in the production of secondary metabolites using the model strain CFBP 5454 of P. corrugata. P. corrugata possesses a canonical quorum sensing (QS) system, PcoI/PcoR, based on the signal molecules acyl-homoserine-lactones (AHL), and in this thesis project we focused on the role of a transcriptional regulator belonging to the LuxR solos family designated SolR. P. corrugata produces the cyclic lipopeptides (CLP) cormycin A and corpeptins A and B. The contribution of cormycin A has been investigated here for the first time. The PCOSOLR and PCOCRMA mutant strains were obtained by inactivating, respectively, solR and crmA genes (the latter coding for a non-ribosomal peptide synthase) of P. corrugata CFBP 5454 and the resulting mutational phenotypes were studied. PCOSOLR mutant strain was able to induce hypersensitive response (HR) in the non-host plant tobacco and was more virulent in tomato, probably due to an increased production of CLP with phytotoxic activity. Instead, phenotype analysis of PCOCRMA mutant strain suggested that this strain produces fewer antimicrobial compounds than the wild-type strain. PCOCRMA was in fact unable to cause HR in tobacco and to inhibit the growth of some microorganisms sensitive to CLP, while the symptoms of pith necrosis in tomato were significantly reduced. Based on these results, SolR and CrmA play an important role in the interactions of P. corrugata with plants, in virulence, in broad-spectrum antimicrobial activity and, presumably, in the ability of this bacterium to colonize new ecological niches.

Il Mal secco (MSD) è una grave tracheomicosi degli agrumi causata dal fungo mitosporico Plenodomus tracheiphilus (Pt). In questo studio abbiamo esaminato l'effetto dell'infezione da MSD sulle comunità microbiche delle radici (rizosfera ed endorizosfera) e dell’endosfera dello xilema di semenzali di Citrus aurantium (arancio amaro) a seguito dell’inoculazione fogliare e radicale con Pt attraverso un’analisi metagenomica basata sul sequenziamento degli ampliconi dei geni 16S rDNA e ITS. L'agente patogeno è stato rilevato mediante real-time PCR nelle radici delle piante inoculate per via radicale e nello xilema di quelle inoculate sia per via fogliare che per via radicale. I nostri risultati suggeriscono che l'infezione fogliare e radicale con Pt alteri la composizione delle comunità batteriche e fungine dei compartimenti analizzati mediante una diminuzione o un aumento dell'abbondanza di alcuni taxa chiave. Il genere Pseudomonas, che comprende ceppi con nota attività di biocontrollo, è stato il primo taxon rappresentato nella rizosfera e il secondo nell'endorizosfera sia delle piante inoculate che in quelle non inoculate. Secondo l'analisi dell'abbondanza differenziale, le popolazioni batteriche di questo genere erano significativamente ridotte nelle radici dei semenzali inoculati con il patogeno. L'analisi delle co-occurrence networks ha inoltre suggerito, nel complesso, un cambiamento nella struttura delle comunità microbiche a seguito dell'infezione con P. tracheiphilus. Il subclade di P. corrugata (P. corrugata, P. mediterranea, P. brassicacearum, P. thivervalensis, P. kilonensis) presenta attività di promozione della crescita delle piante e di biocontrollo nei confronti di diversi agenti fitopatogeni. Una collezione di ceppi di P. corrugata e P. mediterranea del laboratorio di Fitobatteriologia (Di3A) è stata sottoposta a screening in vitro per l'attività di biocontrollo nei confronti di diversi isolati di P. tracheiphilus. Tutti i ceppi batterici testati hanno mostrato un'attività antagonistica in vitro, anche se in misura diversa. I due ceppi di biocontrollo più efficaci in vitro, P. corrugata PVCT 4.3t e P. mediterranea PVCT 3C, sono stati selezionati per ulteriori test antagonistici in vivo e per il sequenziamento dell'intero genoma (WGS). Entrambi i ceppi hanno ridotto significativamente l'incidenza e la gravità dei sintomi di MSD in piante di limone e arancio amaro soprattutto nelle prime fasi dell'infezione. Per studiare i geni potenzialmente coinvolti nell'attività di biocontrollo, il DNA genomico totale di entrambi i ceppi è stato estratto e sequenziato utilizzando la piattaforma Illumina NovaSeq PE150. Sulla base dell'output di sequenziamento, i genomi di P. corrugata PVCT 4.3t e P. mediterranea PVCT 3C ospitano numerosi cluster di geni biosintetici che codificano principalmente per sintetasi peptidiche di tipo non ribosomiale (NRPS) coinvolte nella produzione di composti antimicrobici. Nel complesso, questi risultati indicano che i due ceppi selezionati sono agenti di controllo biologico efficaci sia in vitro che in vivo nei confronti di P. tracheiphilus. In base ai risultati ottenuti dall'analisi del genoma, abbiamo inoltre studiato il ruolo biologico di due geni (crmA, solR), mai indagato prima, nella produzione di metaboliti secondari utilizzando il ceppo modello di P. corrugata CFBP 5454. P. corrugata possiede un sistema quorum sensing (QS) canonico, PcoI/PcoR, basato sulle molecole segnale acil-omoserina-lattoni (AHL) e in questo progetto di tesi ci siamo focalizzati sul ruolo di un regolatore trascrizionale appartenente alla famiglia dei LuxR solos designato SolR. P. corrugata produce i lipopeptidi ciclici (CLP) cormicina A e le corpeptine A e B. Il contributo della cormicina A è stato qui studiato per la prima volta. I ceppi mutanti PCOSOLR e PCOCRMA sono stati ottenuti inattivando, rispettivamente, i geni solR e crmA (quest’ultimo codificante per una sintasi peptidica di tipo non ribosomiale) di P. corrugata CFBP 5454 e sono stati studiati i fenotipi mutazionali risultanti. Il ceppo mutante PCOSOLR è stato in grado di indurre la reazione ipersensibile (HR) nella pianta non ospite tabacco ed è risultato più virulento in pomodoro, probabilmente a causa di un'incrementata produzione di CLP con attività fitotossica. L'analisi del fenotipo del ceppo mutante PCOCRMA ha invece suggerito che questo ceppo produca meno composti antimicrobici rispetto al ceppo wild-type. PCOCRMA non è stato infatti in grado di causare HR in tabacco e di inibire la crescita di alcuni microorganismi sensibili ai CLP, mentre i sintomi della necrosi del midollo in pomodoro sono risultati notevolmente ridotti. Sulla base di questi risultati, SolR e CrmA giocano un ruolo importante nelle interazioni di P. corrugata con le piante, nella virulenza, nell'attività antimicrobica ad ampio spettro e, presumibilmente, nella capacità di questo batterio di colonizzare nuove nicchie ecologiche.