Ruolo della metilazione del DNA nella regolazione di SLC22A17 nel melanoma cutaneo

Cutaneous melanoma represents one of the deadliest forms of skin cancer due to its high invasiveness and metastatic tendency. Despite recent advances in screening programs and the development of innovative therapeutic strategies (e.g. targeted therapy and immunotherapy) have allowed to ameliorate the management of cancer patients, melanoma incidence and mortality rates are constantly increasing worldwide highlighting the need for novel diagnostic and prognostic biomarkers, as well as new potential therapeutic targets. In this regard, a growing number of studies have recently highlighted that the development of cutaneous melanoma is not only associated with gene mutations but also with epigenetic alterations, which may induce the dysregulation of oncogenes and tumor suppressor genes, as well as the activation of different signaling pathways involved in cancer initiation and progression. Among the epigenetic alterations, DNA methylation is the most characterized playing a critical role in the regulation of cancer-related genes. As widely reported in the literature, promoter hypomethylation is strictly associated to activation of oncogenes. Similarly, intragenic DNA methylation seems to be actively involved in transcriptional regulatory processes; however, its functional role has not been completely elucidated yet. Of note, several studies reported that tumor microenvironment-related genes are epigenetically regulated by DNA methylation, including the Gelatinase-Associated Lipocalin (NGAL) and its receptor Solute Carrier Family 22 Member 17 (SLC22A17) that are involved in iron trafficking mediating either the iron influx or efflux through the cell membrane. On these bases, the present study aimed to investigate the role of DNA methylation in the regulation of SLC22A17 gene expression in cutaneous melanoma, as well as the involvement of NGAL/SLC22A17 axis in iron homeostasis and ferroptosis. To this purpose, bioinformatic analyses were conducted by using The Cancer Genome Atlas (TCGA) and Gene Expression Omnibus (GEO) datasets to evaluate the SLC22A17 expression and DNA methylation profiling in cutaneous melanoma and identify putative methylation hotspots as diagnostic and prognostic biomarkers. In addition, in vitro functional studies were conducted on different melanoma cell lines to assess the correlation between DNA methylation and expression of SLC22A17 by 5-azacytidine (5-Aza) treatment, whereas ammonium iron (III) citrate, 1S,3R-RSL 3, and Erastin treatments allowed to explore the role of NGAL/SLC22A17 axis in iron trafficking and ferroptosis. In particular, the effect of ferroptosis activators was assessed in A375 cells transfected with NGAL and SLC22A17 variants 1, 2, and 3. Validation study was also conducted analyzing the methylation levels of the in silico identified cg17199325 hotspot in FFPE melanoma and nevi samples by the custom Methylation-Sensitive Restriction Enzyme-droplet digital PCR (MSRE-ddPCR) assay to evaluate its clinical relevance as epigenetic biomarker for cutaneous melanoma. The computational analyses showed a significant downregulation of SLC22A17 in melanoma patients compared to healthy controls, suggesting that SLC22A17 could act as a tumor suppressor gene. Moreover, a strong positive correlation was observed between SLC22A17 gene/variants expression and intragenic DNA methylation. The bioinformatic results were further confirmed by the in vitro study on 5-Aza treated melanoma cells, which demonstrated that SLC22A17 expression is strictly regulated by the DNA methylation status of both promoter and body regions. Interestingly, the MSRE-ddPCR analysis revealed that the DNA methylation levels of the in silico identified cg17199325 hotspot were higher in FFPE melanoma samples compared to nevi and related to disease progression. Finally, the A375 cells overexpressing SLC22A17 variant 3 (A375Empty/SLC22A17Var3) acquired resistance to iron overload and 1S,3R-RSL 3 treatment. However, the baseline sensitivity was restored by the concomitant overexpression of NGAL (A375NGAL/SLC22A17Var3), indicating that NGAL/SLC22A17 axis could play a critical role in ferroptosis of melanoma cells. Overall, the results of this study indicated that the cg17199325 hotspot could represent a promising diagnostic biomarker of cutaneous melanoma, highlighting the regulatory role of DNA methylation on the SLC22A17 gene expression. However, the results obtained so far need to be clinically validated in a larger cohort of melanoma patients. In addition, the involvement of SLC22A17 variant 3 in ferroptosis resistance could pave the way to the development of novel effective strategies for the treatment of melanoma patients.

Il melanoma cutaneo rappresenta una delle forme più letali di cancro della pelle a causa della sua elevata invasività e tendenza alla metastatizzazione. Nonostante i recenti progressi nei programmi di screening e lo sviluppo di strategie terapeutiche innovative (ad esempio target therapy ed immunoterapia) abbiano permesso di migliorare la gestione dei pazienti affetti da tumore, i tassi di incidenza e mortalità del melanoma sono in costante aumento in tutto il mondo, evidenziando la necessità di nuovi biomarcatori diagnostici e prognostici, nonché di nuovi potenziali target terapeutici. A questo proposito, un numero crescente di studi ha recentemente messo in evidenza che lo sviluppo del melanoma cutaneo è associato non solo a mutazioni genetiche ma anche ad alterazioni epigenetiche che possono indurre la disregolazione di oncogeni e geni soppressori del tumore, nonché l'attivazione di diverse vie di segnalazione coinvolte nello sviluppo e progressione del cancro. Tra le alterazioni epigenetiche, la metilazione del DNA è la più caratterizzata e svolge un ruolo critico nella regolazione dei geni correlati al cancro. Come ampiamente riportato in letteratura, l'ipometilazione del promotore è strettamente associata all'attivazione di oncogeni. Allo stesso modo, la metilazione intragenica sembra essere attivamente coinvolta nei processi di regolazione trascrizionale; tuttavia, il suo ruolo funzionale non è stato ancora completamente chiarito. Diversi studi hanno riportato che i geni correlati al microambiente tumorale sono regolati epigeneticamente dalla metilazione del DNA, tra cui la gelatinasi associata alla lipocalina (NGAL) e il suo recettore Solute Carrier Family 22 Member 17 (SLC22A17), entrambi coinvolti nell'omeostasi del ferro mediandone l'afflusso o l'efflusso attraverso la membrana cellulare. Su queste basi, il presente studio ha voluto indagare il ruolo della metilazione del DNA nella regolazione dell'espressione genica di SLC22A17 nel melanoma cutaneo, nonché il coinvolgimento dell'asse NGAL/SLC22A17 nell'omeostasi del ferro e nella ferroptosi. A tal fine, sono state condotte analisi bioinformatiche utilizzando i dataset The Cancer Genome Atlas (TCGA) e Gene Expression Omnibus (GEO) per valutare l'espressione di SLC22A17 e il profilo di metilazione del DNA nel melanoma cutaneo e identificare hotspots di metilazione come potenziali biomarcatori diagnostici e prognostici. Inoltre, sono stati condotti studi funzionali in vitro su diverse linee cellulari di melanoma per valutare la correlazione tra la metilazione del DNA e l'espressione di SLC22A17 mediante il trattamento con l'agente demetilante 5-azacitidina (5-Aza), mentre l'ammonio ferrico citrato, 1S,3R-RSL 3 ed Erastin hanno permesso di esplorare il ruolo dell'asse NGAL/SLC22A17 nell'omeostasi del ferro e nella ferroptosi. In particolare, l'effetto degli attivatori della ferroptosi è stato valutato in cellule A375 trasfettate con NGAL e le varianti 1, 2 e 3 di SLC22A17. È stato inoltre condotto uno studio di validazione analizzando i livelli di metilazione dell'hotspot cg17199325 identificato in silico in campioni FFPE di melanoma e nevi mediante il saggio custom Methylation-Sensitive Restriction Enzyme-droplet digital PCR (MSRE-ddPCR) per valutarne la rilevanza clinica come biomarcatore epigenetico per il melanoma cutaneo. Le analisi computazionali hanno mostrato una significativa downregolazione di SLC22A17 nei pazienti affetti da melanoma rispetto ai controlli sani, suggerendo che SLC22A17 potrebbe agire come gene soppressore del tumore. Inoltre, è stata osservata una forte correlazione positiva tra l'espressione di SLC22A17 e la metilazione intragenica. I risultati bioinformatici sono stati ulteriormente confermati dallo studio in vitro su cellule di melanoma trattate con 5-Aza, dimostrando che l'espressione di SLC22A17 è strettamente regolata dallo stato di metilazione del DNA sia del promotore che del corpo del gene. È interessante notare che l'analisi MSRE-ddPCR ha rivelato che i livelli di metilazione del DNA dell'hotspot cg17199325 erano più elevati nei campioni FFPE di melanoma rispetto ai nevi e correlati alla progressione della malattia. Infine, le cellule A375 che overesprimevano la variante 3 di SLC22A17 (A375Empty/SLC22A17Var3) mostravano un aumento della resistenza al trattamento con ammonio ferrico citrato e 1S,3R-RSL 3. Tuttavia, la sensibilità basale è stata ripristinata dalla concomitante overespressione di NGAL (A375NGAL/SLC22A17Var3), indicando che l'asse NGAL/SLC22A17 potrebbe svolgere un ruolo critico nella ferroptosi delle cellule di melanoma. Nel complesso, i risultati di questo studio indicano che l'hotspot cg17199325 potrebbe rappresentare un promettente biomarcatore diagnostico del melanoma cutaneo, evidenziando il ruolo regolatorio della metilazione del DNA sull'espressione del gene SLC22A17. Tuttavia, i risultati ottenuti finora devono essere validati clinicamente in una coorte più ampia di pazienti affetti da melanoma. Inoltre, il coinvolgimento della variante 3 di SLC22A17 nella resistenza alla ferroptosi potrebbe aprire la strada allo sviluppo di nuove strategie efficaci per il trattamento dei pazienti affetti da melanoma.