Impiego di indicatori chimici, biochimici e molecolari per la valutazione degli effetti indotti da contaminanti ambientali in organismi marini: dall’early warning alla previsione degli effetti a lungo termine sulle performance

Starting from a knowledge gap inherent in the causal link between the release and determination of contaminants in the marine environment on the one hand, and the actual impact they may have on biological systems on the other, this thesis sets out to define chemical, biochemical and molecular indicators for the assessment of the effects induced by environmental contaminants in marine organisms: from early warning to the prediction of long-term effects on performance. Therefore, the European and national regulatory context with reference to contaminated sites was briefly described, with a focus on the criticalities inherent in the information flow between Member States in relation to the risks associated with the various contaminated areas, which gives rise to segmented and heterogeneous data at EU level, and the absence of standards capable of establishing the extent to which a polluted site poses significant risks to the environment and human health. The study area is then presented, namely the Augusta roadstead, falling within the marine perimeter of the contaminated Site of National Interest (SIN) of Augusta-Priolo Gargallo. By way of general background, the historical and ethnographic context persisting in post-war Sicily that catalysed the development of the Syracuse petrochemical industry is briefly presented. The main geological and morphobatimetric characteristics of the port are then described for a better understanding of its importance in the Mediterranean basin, both in economic-commercial terms and as an important source of accumulation and evacuation of numerous contaminants. Finally, the gradual process of industrialisation underlying the historical contamination was presented. Next, the experimental design was described. It involved: the definition and implementation of the sampling plan; the definition of the target fish species; the selection of the tissues and subsequent dissections; the collection and storage of the matrices in relation to the various analyses to which they were destined; and the recording of the biometric measurements. Sampling was carried out by selective fishing with gillnets or trawls. For the pursuit of the set objectives, the definition of the target species took into account not only the levels of contaminant accumulation, sedentariness, representativeness and abundance of the species in the survey area, but also their belonging to different trophic levels. Chapter 5 presents the processing of fish samples for trace element analysis and the determination of mercury bioaccumulation. Building on numerous previous studies, the focus is on mercury as a descriptor of the spatial and temporal extent of contamination in the study area. Thus, the different levels of mercury (Hg) present in the target species and interpreted as a common thread, allowed for the identification of a subset of samples for the assessment of the numerous biomarkers selected to pursue the main objective of the investigation and described in the following chapters. In addition, the chapter presents the evaluation of some condition indices as biological parameters useful for defining the possible effects of chronic exposure to chemical contaminants on the ichthyofauna of the Augusta Rada and relates them to the bioaccumulation levels of Hg determined. Chapter 6 describes the relationships, relatively little investigated to date in wild marine organisms, between oxidative stress, free radical scavenging proteins and general responses of the entire antioxidant system. Specifically, 'novel' biomarker responses involved in the mechanisms of immunity, apoptosis, hypoxia and energy balance, and glucose and fatty acid metabolism are defined and carefully integrated with the aim of identifying metabolic state 'sensors' whose variation leads to changes in homeostasis and cell cycle. In addition, biochemical markers involved in fatty acid metabolism and lipid peroxidation are investigated for the assessment of oxidative stress resulting from chronic exposure to chemical contaminants present in sub-lethal concentrations in the study area. Chapter 7 validates the analysis of mitochondrial DNA copy number variation (mtDNAcn), so far widely used mainly in the diagnosis of human carcinogenesis or in model organism studies, as a tool for defining the impact of chemical contaminants in the marine environment as an insult capable of triggering oxidative stress in exposed species. The experimental setup on hitherto poorly investigated target fish species is described, and the results from the tests conducted and the resulting preliminary observations are reported. In the end, the observations from the research conducted are contextualised with the state of the art regarding the multi-marker approach as a tool for environmental monitoring and risk analysis associated with anthropogenic pressures in the marine environment. It offers an integrated synthesis of the main scientific evidence observed, proposing, on the one hand, a model of molecular and biochemical biomarkers as 'early' sensors for the definition of the possible fallout, even if not visibly toxic, on marine biological systems deriving from chemical contaminants, and, on the other, possible investigative insights to improve the understanding of the real impact that these contaminants could have on marine systems, heralding a trans-disciplinary management of contaminated areas.

Partendo da una lacuna conoscitiva inerente il nesso di causalità tra il rilascio e la determinazione dei contaminanti nell’ambiente marino da un lato, ed il reale impatto che essi potrebbero avere sui sistemi biologici dall’altro, la presente tesi si pone l'obiettivo generale del progetto di definire indicatori chimici, biochimici e molecolari per la valutazione degli effetti indotti da contaminanti ambientali in organismi marini: dall’early warning alla previsione degli effetti a lungo termine sulle performance. E' stato pertanto descritto sinteticamente il contesto normativo europeo e nazionale in riferimento ai siti contaminati con un focus sulle criticità inerenti il flusso informativo tra gli Stati Membri in relazione ai rischi associati alle diverse aree contaminate che origina dati segmentati ed eterogenei a livello comunitario e l’assenza di standard in grado di stabilire quanto un sito inquinato determini rischi significativi per la salute dell’ambiente e delle persone. Viene poi presentata l’area studio, ovvero la rada di Augusta, ricadente nel perimetro marino del Sito contaminato di Interesse Nazionale (SIN) di Augusta-Priolo Gargallo. A titolo di inquadramento generale, viene brevemente presentato il contesto storico ed etnografico insistente nella Sicilia dell’immediato dopoguerra che ha catalizzato lo sviluppo del petrolchimico siracusano. Vengono poi descritte le principali caratteristiche geologiche e morfobatimetriche del porto per una migliore comprensione dell’importanza che esso rappresenta a livello di bacino del Mediterraneo sia in termini economico-commerciali che come importante fonte di accumulo ed evasione di numerosi contaminanti. Viene in ultimo presentato il graduale processo di industrializzazione alla base della contaminazione storica. A seguire è stato descritto il disegno sperimentale. Esso ha previsto: la definizione e la realizzazione del piano di campionamento; la definizione delle specie ittiche target; la scelta dei tessuti e le successive dissezioni; il collezionamento e lo stoccaggio delle matrici in relazione alle diverse analisi a cui sono state destinate; la registrazione dei rilievi biometrici. Il campionamento è avvenuto mediante pesca selettiva con reti da posta o strascico. Per il perseguimento degli obiettivi prefissati, la definizione delle specie target ha tenuto conto, oltre che dei livelli di accumulo dei contaminanti, sedentarietà, rappresentatività e abbondanza delle specie nell’area di indagine, anche dell’appartenenza a livelli trofici differenti. Il Capitolo 5 presenta il processamento dei campioni ittici per l’analisi degli elementi in traccia e la determinazione del bioaccumulo di mercurio. Partendo dai numerosi studi pregressi, il focus è posto sul mercurio come descrittore della dimensione spaziale e temporale della contaminazione nell’area studio. Dunque, i diversi livelli di mercurio (Hg) presenti nelle specie target e interpretati come fil rouge, hanno permesso di identificare un subset di campioni per la valutazione dei numerosi biomarker selezionati per il perseguimento dell’obiettivo principale dell’indagine e descritti nei capitoli successivi. In aggiunta, il capitolo presenta la valutazione di alcuni indici di condizione quali parametri biologici utili a definire i possibili effetti dell’esposizione cronica ai contaminanti chimici sull’ittiofauna della Rada di Augusta e li mette in relazione ai livelli di bioaccumulo di Hg determinati. Nel capitolo 6 sono descritte le relazioni, ad oggi relativamente poco indagate negli organismi marini selvatici, che intercorrono tra stress ossidativo, proteine deputate allo scavenging dei radicali liberi e risposte generali dell’intero sistema antiossidante. Nello specifico, vengono definite ed attentamente integrate le risposte di biomarker “innovativi” coinvolti nei meccanismi di immunità, apoptosi, ipossia e bilancio energetico e nel metabolismo di glucosio e acidi grassi con lo scopo di individuare “sensori” dello stato metabolico la cui variazione porta a modificazioni di omeostasi e ciclo cellulare. Inoltre, vengono indagati marcatori biochimici coinvolti nel metabolismo degli acidi grassi e nella perossidazione lipidica per la valutazione dello stress ossidativo derivante dall’esposizione cronica ai contaminanti chimici presenti in concentrazioni sub-letali nell’area studio. Il capitolo 7 valida l’analisi della variazione del numero di copie di DNA mitocondriale (mtDNAcn), finora ampiamente utilizzato soprattutto nella diagnosi della cancerogenesi umana o in studi su organismi modello, come strumento per la definizione dell’impatto dei contaminanti chimici in ambiente marino quale insulto in grado di innescare stress ossidativo nelle specie esposte. Viene descritto il setup sperimentale sulle specie ittiche target ad oggi scarsamente indagate e sono riportati i risultati derivanti dai test condotti e le conseguenti osservazioni preliminari. A chiusura vengono contestualizzate le osservazioni derivanti dalla ricerca condotta con lo stato dell’arte circa l’approccio multimarker quale strumento per il monitoraggio ambientale e l’analisi del rischio associato alle pressioni antropiche in ambiente marino. Offre una sintesi integrata delle principali evidenze scientifiche osservate proponendo, da un lato, un modello di biomarcatori molecolari e biochimici quali sensori “precoci” per la definizione delle possibili ricadute, anche non visibilmente tossiche, sui sistemi biologici marini derivanti dai contaminanti chimici, dall’altro, possibili spunti di indagine per migliorare la comprensione del reale impatto che detti contaminanti potrebbero avere sui sistemi marini forieri di una gestione transidisciplinare delle aree contaminate.