Confocal microscopy and super-resolution microscopy, also known as Image Scanning Microscopy (ISM), are two powerful tools for high-resolution optical imaging, widely used in biomedical research. However, both techniques are subject to diffraction limitations, which restrict their spatial resolution. This PhD thesis introduces and develops a new algorithm, called SPLIT (Separation of Photons by Lifetime Tuning), that overcomes these limitations by significantly improving the resolution of images obtained with both confocal microscopy and ISM. In confocal microscopy, the SPLIT algorithm is applied by analyzing the intensity as a function of the variation of the pinhole, a key element that governs the image resolution. The SPLIT-Pinhole (SPLIT-PIN) algorithm exploits this variability to remove the signal outside the images, increasing resolution and contrast. As for Image Scanning Microscopy, the SPLIT-Image scanning microscope algorithm uses the information derived from the distance between the detectors in the array and the central detector, further improving the image resolution. The results demonstrate that the SPLIT algorithm is able to overcome the diffraction limit in both techniques, opening new possibilities for the detailed study of sub-cellular structures and complex biological processes. The thesis is organized in four main chapters. The first chapter provides an introduction to fluorescence microscopy, outlining the fundamental principles and the main techniques employed in the field of microscopy. The second chapter focuses on the improvement of resolution in confocal microscopy, LEICA TCS SP8, through the application of the SPLIT-PIN algorithm, describing its operation and analyzing the experimental results. The third chapter explores the application of the SPLIT-ISM algorithm to improve resolution in Image Scanning Microscopy, in particular its application on two instruments that are the LSM 880 ZEISS Airyscan and the GenoaInstruments PRISM, highlighting the differences and similarities of the two microscopy systems and reporting the results on the improvement in resolution. Finally, the fourth chapter discusses the practical applications of these advanced techniques in the study of chromatin, demonstrating how the increase in resolution obtained can contribute to the understanding of epigenetic mechanisms and the dynamics of chromatin structure.

La microscopia confocale e la microscopia a super-risoluzione, note anche come microscopia a scansione di immagini (ISM), sono due potenti strumenti per l'imaging ottico ad alta risoluzione, ampiamente utilizzati nella ricerca biomedica. Tuttavia, entrambe le tecniche sono soggette a limitazioni di diffrazione, che ne limitano la risoluzione spaziale. Questa tesi di dottorato introduce e sviluppa un nuovo algoritmo, denominato SPLIT (Separation of Photons by Lifetime Tuning), che supera queste limitazioni migliorando significativamente la risoluzione delle immagini ottenute sia con la microscopia confocale che con l'ISM. Nella microscopia confocale, l'algoritmo SPLIT viene applicato analizzando l'intensità in funzione della variazione del pinhole, un elemento chiave che governa la risoluzione dell'immagine. L'algoritmo SPLIT-Pinhole (SPLIT-PIN) sfrutta questa variabilità per rimuovere il segnale al di fuori delle immagini, aumentando la risoluzione e il contrasto. Per quanto riguarda la microscopia a scansione di immagini, l'algoritmo SPLIT-Image scanning microscope utilizza le informazioni derivate dalla distanza tra i rilevatori nell'array e il rilevatore centrale, migliorando ulteriormente la risoluzione dell'immagine. I risultati dimostrano che l'algoritmo SPLIT è in grado di superare il limite di diffrazione in entrambe le tecniche, aprendo nuove possibilità per lo studio dettagliato di strutture subcellulari e processi biologici complessi. La tesi è organizzata in quattro capitoli principali. Il primo capitolo fornisce un'introduzione alla microscopia a fluorescenza, delineando i principi fondamentali e le principali tecniche impiegate nel campo della microscopia. Il secondo capitolo si concentra sul miglioramento della risoluzione nella microscopia confocale, LEICA TCS SP8, attraverso l'applicazione dell'algoritmo SPLIT-PIN, descrivendone il funzionamento e analizzandone i risultati sperimentali. Il terzo capitolo esplora l'applicazione dell'algoritmo SPLIT-ISM per migliorare la risoluzione nella microscopia a scansione di immagini, in particolare la sua applicazione su due strumenti che sono l'LSM 880 ZEISS Airyscan e il GenoaInstruments PRISM, evidenziando le differenze e le somiglianze dei due sistemi di microscopia e riportando i risultati sul miglioramento della risoluzione. Infine, il quarto capitolo discute le applicazioni pratiche di queste tecniche avanzate nello studio della cromatina, dimostrando come l'aumento di risoluzione ottenuto possa contribuire alla comprensione dei meccanismi epigenetici e delle dinamiche della struttura della cromatina.

Sviluppo e ottimizzazione di tecniche di bioimaging ad alta risoluzione spaziale basate su strategie di rilevamento innovative / DI FRANCO, Elisabetta. - (2025 Jan 21).

Sviluppo e ottimizzazione di tecniche di bioimaging ad alta risoluzione spaziale basate su strategie di rilevamento innovative

DI FRANCO, ELISABETTA
2025-01-21

Abstract

Confocal microscopy and super-resolution microscopy, also known as Image Scanning Microscopy (ISM), are two powerful tools for high-resolution optical imaging, widely used in biomedical research. However, both techniques are subject to diffraction limitations, which restrict their spatial resolution. This PhD thesis introduces and develops a new algorithm, called SPLIT (Separation of Photons by Lifetime Tuning), that overcomes these limitations by significantly improving the resolution of images obtained with both confocal microscopy and ISM. In confocal microscopy, the SPLIT algorithm is applied by analyzing the intensity as a function of the variation of the pinhole, a key element that governs the image resolution. The SPLIT-Pinhole (SPLIT-PIN) algorithm exploits this variability to remove the signal outside the images, increasing resolution and contrast. As for Image Scanning Microscopy, the SPLIT-Image scanning microscope algorithm uses the information derived from the distance between the detectors in the array and the central detector, further improving the image resolution. The results demonstrate that the SPLIT algorithm is able to overcome the diffraction limit in both techniques, opening new possibilities for the detailed study of sub-cellular structures and complex biological processes. The thesis is organized in four main chapters. The first chapter provides an introduction to fluorescence microscopy, outlining the fundamental principles and the main techniques employed in the field of microscopy. The second chapter focuses on the improvement of resolution in confocal microscopy, LEICA TCS SP8, through the application of the SPLIT-PIN algorithm, describing its operation and analyzing the experimental results. The third chapter explores the application of the SPLIT-ISM algorithm to improve resolution in Image Scanning Microscopy, in particular its application on two instruments that are the LSM 880 ZEISS Airyscan and the GenoaInstruments PRISM, highlighting the differences and similarities of the two microscopy systems and reporting the results on the improvement in resolution. Finally, the fourth chapter discusses the practical applications of these advanced techniques in the study of chromatin, demonstrating how the increase in resolution obtained can contribute to the understanding of epigenetic mechanisms and the dynamics of chromatin structure.
21-gen-2025
La microscopia confocale e la microscopia a super-risoluzione, note anche come microscopia a scansione di immagini (ISM), sono due potenti strumenti per l'imaging ottico ad alta risoluzione, ampiamente utilizzati nella ricerca biomedica. Tuttavia, entrambe le tecniche sono soggette a limitazioni di diffrazione, che ne limitano la risoluzione spaziale. Questa tesi di dottorato introduce e sviluppa un nuovo algoritmo, denominato SPLIT (Separation of Photons by Lifetime Tuning), che supera queste limitazioni migliorando significativamente la risoluzione delle immagini ottenute sia con la microscopia confocale che con l'ISM. Nella microscopia confocale, l'algoritmo SPLIT viene applicato analizzando l'intensità in funzione della variazione del pinhole, un elemento chiave che governa la risoluzione dell'immagine. L'algoritmo SPLIT-Pinhole (SPLIT-PIN) sfrutta questa variabilità per rimuovere il segnale al di fuori delle immagini, aumentando la risoluzione e il contrasto. Per quanto riguarda la microscopia a scansione di immagini, l'algoritmo SPLIT-Image scanning microscope utilizza le informazioni derivate dalla distanza tra i rilevatori nell'array e il rilevatore centrale, migliorando ulteriormente la risoluzione dell'immagine. I risultati dimostrano che l'algoritmo SPLIT è in grado di superare il limite di diffrazione in entrambe le tecniche, aprendo nuove possibilità per lo studio dettagliato di strutture subcellulari e processi biologici complessi. La tesi è organizzata in quattro capitoli principali. Il primo capitolo fornisce un'introduzione alla microscopia a fluorescenza, delineando i principi fondamentali e le principali tecniche impiegate nel campo della microscopia. Il secondo capitolo si concentra sul miglioramento della risoluzione nella microscopia confocale, LEICA TCS SP8, attraverso l'applicazione dell'algoritmo SPLIT-PIN, descrivendone il funzionamento e analizzandone i risultati sperimentali. Il terzo capitolo esplora l'applicazione dell'algoritmo SPLIT-ISM per migliorare la risoluzione nella microscopia a scansione di immagini, in particolare la sua applicazione su due strumenti che sono l'LSM 880 ZEISS Airyscan e il GenoaInstruments PRISM, evidenziando le differenze e le somiglianze dei due sistemi di microscopia e riportando i risultati sul miglioramento della risoluzione. Infine, il quarto capitolo discute le applicazioni pratiche di queste tecniche avanzate nello studio della cromatina, dimostrando come l'aumento di risoluzione ottenuto possa contribuire alla comprensione dei meccanismi epigenetici e delle dinamiche della struttura della cromatina.
Microscopy; Fluorescence; Chromatin; Super-Resolution; Resolution; Algorithm; SPLIT
Microscopia; Fluorescenza; Cromatina; Super-Risoluzione; Risoluzione; Algoritmo; SPLIT
Sviluppo e ottimizzazione di tecniche di bioimaging ad alta risoluzione spaziale basate su strategie di rilevamento innovative / DI FRANCO, Elisabetta. - (2025 Jan 21).
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.11769/658291
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