Development of molecular markers for traceability and breeding in sweet orange [Sviluppo di marcatori molecolari per la tracciabilità e il breeding in arancio dolce]

Sweet orange (Citrus sinensis (L.) Osbeck) is one of the most widely cultivated fruit crops globally, valued for its economic, cultural, and nutritional importance. This doctoral thesis focuses on the application of whole-genome sequencing tools to identify molecular markers that can be employed for traceability and in future breeding plans. In this context, one objective was to establish DNAbased markers using single nucleotide polymorphisms (SNPs), for true-to-type analysis aimed at distinguishing sweet orange clones and ensuring varietal authenticity from farm to consumer. Moreover, whole-genome sequencing data coupled with phenotypic data recorded in two consecutive years, were employed for a genome wide association study (GWAS) to identify candidate genes and molecular markers associated with key phenotypic traits. Overall, the research activities focused on: (i) an extensive review of the sweet orange varietal landscape, along with the cuttingedge genomics and biotechnological tools that shape conventional and innovative breeding approaches (new plant breeding techniques, NPBTs); (ii) the identification - and validation using High-Resolution Melting (HRM) analysis - of SNP markers specific for the traceability of the major sweet orange groups cultivated worldwide and for 11 blood orange accessions grown in Italy; (iii) the set-up of a GWAS analysis conducted using a germplasm collection including a total of 117 blood and blond orange accessions. This research represents a significant advancement in the DNAbased traceability of sweet oranges, offering molecular tools for ensuring product authenticity and promoting consumer confidence in high-value orange products. In addition, the GWAS findings offer valuable insights into marker-assisted breeding, enabling the early selection of varieties with superior characteristics.

L'arancio dolce (Citrus sinensis (L.) Osbeck) è una delle colture frutticole più diffuse a livello mondiale, di grande importanza economica, culturale e nutrizionale. Questa tesi di dottorato si basa sull'applicazione di strumenti di sequenziamento dell’intero genoma, al fine di identificare marcatori molecolari che possano essere impiegati per la tracciabilità ed in futuri piani di breeding. In questo contesto, uno degli obiettivi è stato quello di sviluppare marcatori molecolari (DNA-based markers) utilizzando polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs). Tali marcatori verranno utilizzati come strumento di discriminazione tra differenti cloni di arancio dolce, garantendo la rispondenza varietale lungo la filiera, dalla pianta in vivaio sino al frutto e al prodotto trasformato. Inoltre, i dati di sequenziamento genomico, unitamente a quelli rilevati in due anni di caratterizzazione fenotipica, sono stati impiegati per una analisi di associazione genotipo/fenotipo (genome wide association study, GWAS) al fine di identificare geni candidati e marcatori molecolari associati a tratti fenotipici di interesse. Nel complesso, le attività di ricerca si sono concentrate su: (i) un'ampia rassegna del panorama varietale dell’arancio dolce e degli strumenti genomici e biotecnologici d’avanguardia legati agli approcci di selezione tradizionali e innovativi (new plant breeding techniques, NPBTS); (ii) l'identificazione - e la validazione mediante analisi high-resolution melting (HRM) - di marcatori SNP specifici per la tracciabilità dei principali gruppi di arancio dolce coltivati nel mondo e di 11 accessioni a polpa pigmentata coltivate in Italia; (iii) la realizzazione di un'analisi GWAS condotta utilizzando una collezione di germoplasma comprendente un totale di 117 accessioni di arancio dei diversi gruppi varietali. Questa ricerca costituisce un progresso significativo per la tracciabilità dell’arancio dolce basata sull’analisi del DNA, offrendo strumenti molecolari per garantire l'autenticità di prodotti di qualità, certificando la rispondenza varietale degli stessi per i consumatori. Inoltre, i risultati dell’analisi GWAS offrono importanti informazioni impiegabili per la selezione assistita da marcatori, consentendo la selezione precoce di nuove varietà di agrumi con caratteristiche superiori.