Microbiome and plant health, beneficial bacteria for the eco-sustainable protection of tomato from stresses [Microbioma e salute delle piante, batteri benefici per la difesa eco-sostenibile del pomodoro dagli stress]

This PhD project aimed to uncover the mechanisms driving complex interactions within the plant microbiome, with the ultimate goal of developing new bioinoculants as sustainable alternatives to chemical products in tomato cultivation. As one of the world’s most widely cultivated and economically significant horticultural crop, tomato faces major challenges due to biotic and abiotic stress factors that reduce both yield and quality. Growing environmental and health concerns regarding the intensive use of chemical treatments in tomato farming have increased the interest in alternative approaches, particularly focusing on biological control agents (BCAs). Building on a previous project that developed a model system for New Generation Sequencing (NGS)-based analysis of the tomato microbiome’s traceability and profile, the first objective of this PhD project was to isolate and select bacterial endophytes with potential as bioinoculants for promoting growth and controlling diseases in tomatoes. The selected strains were isolated from the endosphere of seeds and roots of tomato plants at different stages of the production chain and were chosen based on the core microbiome analysis. These bacterial strains included both well-known biofertilizers and biocontrol agents (e.g., Pseudomonas and Bacillus) as well as lesser-known genera (e.g., Chryseobacterium, Glutamicibacter, Paenartrhobacter and Leclercia). Interestingly, the selected strains demonstrated beneficial activities in planta, enhancing tomato growth and controlling diseases like Fusarium crown and root rot and bacterial spot, regardless of their in vitro performance. High-quality genomes of each strain were obtained through Oxford Nanopore long-read and Illumina short-read sequencing, enabling an in-depth analysis of their genetic profiles to identify phyto-beneficial traits. From the ten selected strains, three synthetic communities (SynComs) with varying richness and diversity levels were designed and tested for their in vivo potential to enhance plant growth and stress resilience in tomato crop. One SynCom, designated MIX2, exhibited the strongest activity in our trials, prompting further investigation into its effects on resident microbial communities and plant gene expression. In growth chamber trials, MIX2 application to the soil reshaped the rhizosphere bacterial communities, notably affecting low-abundance taxa. Under greenhouse conditions, MIX2, as well as two individual strains belonging to Bacillus and Pseudomonas genera, mitigated water stress in tomato plants, improving both growth and fruit quality. This beneficial effect may be linked to the positive influence on rhizosphere microbiome diversity, which was significantly compromised by water deficiency but successfully restored especially by the SynCom treatment. In a biocontrol trial carried out in the growth chamber, MIX2 reduced the incidence and severity of bacterial spot disease caused by Xanthomonas euvesicatoria pv. perforans (Xep). Analyses of the phyllosphere and rhizosphere microbial community highlighted that both the pathogen and the SynCom treatments reshaped resident community assembly compared to control plants. Transcriptomic analysis of the plant-pathogen-BCA interaction on tomato leaves revealed that Xep inoculation significantly affected gene expression compared to MIX2. Interestingly, only in the presence of the pathogen, MIX2 triggered a priming effect, upregulating plant hormone signalling and phenylpropanoid biosynthesis pathways, notably those related to jasmonic acid (JA) and lignin biosynthesis. Overall, these findings suggest the potential of PGPR as a promising tool for enhancing tomato plant growth and health. A top-down selection approach based on microbiome analysis proved effective in identifying potential bioinoculants. In addition, a proper SynCom design appearead crucial for the successful establishment of the inoculants within the resident microbiome, where they actively interact with the native microbes to promote a more resilient and efficient microbiome assembly. A diverse mixture of bacterial strains may also combine multiple mechanisms of action, enhancing plant gene expression essential for withstanding stress conditions.

Questo progetto di dottorato mira a scoprire i meccanismi che guidano le complesse interazioni all'interno del microbioma vegetale, con l'obiettivo finale di sviluppare nuovi bioinoculanti come alternative sostenibili ai prodotti chimici nella coltivazione del pomodoro. Il pomodoro, una delle colture orticole più diffuse ed economicamente importanti al mondo, deve affrontare sfide importanti a causa di fattori di stress biotici e abiotici che ne riducono la resa e la qualità. Le crescenti preoccupazioni ambientali e sanitarie relative all'uso intensivo di trattamenti chimici nella coltivazione del pomodoro hanno aumentato l'interesse per approcci alternativi, concentrandosi in particolare sugli agenti di controllo biologico (BCA). Sulla base di un progetto precedente che ha sviluppato un sistema modello per l'analisi della tracciabilità e del profilo del microbioma del pomodoro basata sul New Generation Sequencing (NGS), il primo obiettivo di questo progetto di dottorato è stato quello di isolare e selezionare endofiti batterici con un potenziale come bioinoculanti per promuovere la crescita e controllare le malattie nel pomodoro. I ceppi selezionati sono stati isolati dall'endosfera di semi e radici di piante di pomodoro in diverse fasi della catena di produzione e sono stati scelti in base all'analisi del core microbioma. Questi ceppi batterici comprendono sia biofertilizzanti e agenti di biocontrollo ben noti (ad esempio, Pseudomonas e Bacillus) sia generi meno conosciuti (ad esempio, Chryseobacterium, Glutamicibacter, Paenartrhobacter e Leclercia). È interessante notare che i ceppi selezionati hanno dimostrato attività benefiche in pianta, migliorando la crescita del pomodoro e controllando malattie come il marciume del colletto e delle radici e la maculatura batterica, indipendentemente dalle loro prestazioni in vitro. I genomi di alta qualità di ciascun ceppo sono stati ottenuti mediante sequenziamento Oxford Nanopore (long-read) e Illumina (short-read), consentendo un'analisi approfondita dei loro profili genetici per identificare i tratti fito-benefici. Dai dieci ceppi selezionati, sono state progettate tre comunità sintetiche (SynCom) con diversi livelli di ricchezza e diversità, che sono state testate per verificare il loro potenziale in vivo nel migliorare la crescita delle piante e la resilienza agli stress nella coltura del pomodoro. Una SynCom, denominata MIX2, ha mostrato l'attività migliore nelle nostre prove, spingendo a indagare ulteriormente sui suoi effetti sulle comunità microbiche residenti e sull'espressione genica delle piante. Nelle prove in camera di crescita, l'applicazione di MIX2 al suolo ha rimodellato le comunità batteriche della rizosfera, influenzando in particolare i taxa a bassa abbondanza. In condizioni di serra, MIX2, così come due singoli ceppi appartenenti ai generi Bacillus e Pseudomonas, hanno mitigato lo stress idrico nelle piante di pomodoro, migliorando sia la crescita che la qualità dei frutti. Questo effetto benefico può essere legato all'influenza positiva sulla diversità del microbioma della rizosfera, significativamente compromessa dalla carenza idrica ma ripristinata con successo soprattutto dal trattamento con la SynCom. In una prova di biocontrollo condotta in camera di crescita, il MIX2 ha ridotto l'incidenza e la gravità della maculatura batterica causata da Xanthomonas euvesicatoria pv. perforans (Xep). Le analisi delle comunità microbiche della fillosfera e della rizosfera hanno evidenziato che sia il patogeno che il trattamento con la SynCom hanno modificato la struttura della comunità residente rispetto alle piante controllo. L'analisi trascrittomica dell'interazione pianta-patogeno-BCA sulle foglie di pomodoro ha rivelato che l'inoculazione di Xep ha influenzato significativamente l'espressione genica rispetto al MIX2. È interessante notare che solo in presenza del patogeno, il MIX2 ha innescato un effetto di priming, sovra regolando la segnalazione degli ormoni vegetali e le vie biosintetiche dei fenilpropanoidi, in particolare quelle legate all'acido jasmonico (JA) e alla biosintesi della lignina. Nel complesso, questi risultati suggeriscono il potenziale dei PGPR come strumento promettente per migliorare la crescita e la salute delle piante. Un approccio di selezione top-down basato sull'analisi del microbioma si è dimostrato efficace nell'identificare potenziali bioinoculanti. Inoltre, una corretta progettazione delle SynCom risulta cruciale per il successo dell'insediamento degli inoculanti all'interno del microbioma residente, dove interagiscono attivamente con i microrganismi autoctoni per promuovere un assemblaggio del microbioma più resiliente ed efficiente. Una miscela diversificata di ceppi batterici può anche combinare più meccanismi d'azione, migliorando l'espressione genica delle piante, essenziale per resistere alle condizioni di stress.