Species Redescriptions and Novel data on Study Methodologies, Biodiversity and Phylogeny of limno-terrestrial Tardigrades [Ridescrizione di Specie e Nuovi dati su Metodologie di Studio, Biodiversità e Filogenesi dei Tardigradi limno-terrestri]

Tardigrades constitute a phylum of animals (Tardigrada Doyère, 1840) with small body sizes ranging from 50 to approximately 1000 µm, with nearly 1500 species currently known (Degma & Guidetti, 2007, 2024; Guidetti & Bertolani, 2005). They are found wherever there is at least a thin film of water and are therefore considered aquatic animals. They can be found in marine environments (sediments, algae, plants, etc.), freshwater habitats (algae, sediment, etc.), and terrestrial substrates (bryophytes, lichens, soil, leaf litter, etc.). These animals exhibit metamerism, with a body composed of five segments; the first forms the head, while the other four constitute the trunk, each bearing a pair of lobopods. The lobopods, or "legs" without true joints, usually ending with claws or digitations (the latters limited to marine tardigrades), which are of fundamental diagnostic importance. The study of tardigrades today is still significantly influenced by intrinsic characteristics of the group (a problem that was even more pronounced in the past due to less advanced and less effective study tools), difficulties arising from past and incomplete studies, and limited knowledge regarding certain aspects of tardigrade research. Regarding the intrinsic difficulties of the group, which were more obstructive in the past, these mainly include: i) small body size and ii) the presence of a limited number of non-deformable sclerotized structures (whose measurements are the only quantitative characters with a reduced margin of error). Regarding modern difficulties: i) the lack of in-depth studies on intraspecific and interspecific variability, which are currently available for only a few species, and ii) limited knowledge of their ecology, faunistics, and biogeography still pose challenges to tardigradologists. Additionally, the following difficulties arising from past studies continue to affect modern research: i) the absence or deterioration of type material for many species described in the past, ii) past species descriptions were often based only on drawings or did not consider morphological characters that are now diagnostic; this precludes a reliable comparison with species described in the past, especially when access to the type material is difficult. Due to those issues, many species described in the past using outdated taxonomic criteria and tools are very difficult to identify with certainty. Therefore, it would be necessary to obtain new specimens from the type localities to redescribe them according to modern criteria and with more complete and current methodologies. This problem might seem purely taxonomic and is therefore not always given due consideration, but it must be emphasized that accurate species diagnosis is essential for studying and considering any organism in any field of biological sciences. Thus, the main objective of the present investigations on limno-terrestrial tardigrades is to contribute to filling these gaps, starting with the problem of study techniques and extending to the taxonomy and systematics of species through integrative description and redescription studies. All this, also with phylogenetic analyses when possible. Techniques for preparing animals and eggs for SEM (Scanning Electron Microscopy) analysis were evaluated and discussed, and target species (species needing redescription) were identified and studied, where possible, using modern study techniques, including PCM (Phase Contrast Microscopy), SEM, and analysis of the 4 most widely used molecular markers for tardigrades (ribosomal markers 18S, 28S, and ITS2, and the mitochondrial marker COI). Subsequent to the present first introductory chapter This Ph.D. thesis is composed of four chapters: The second chapter deals with the investigations conducted and the results obtained (sometimes collateral) regarding certain methodologies for studying limno-terrestrial tardigrades; this led to the development of a new protocol, which requires few inexpensive and easily obtainable materials, for preparing animals for SEM analysis. The third chapter focuses on the data collected through the study of substrates (moss, lichens, and leaf litter) resampled in Sicily in the type localities of species previously described for Sicily. A total of 61 samples were collected, revealing 35 taxonomic entities. Four target species, requiring integrative redescription, were found; of these, two were redescribed (Eremobiotus alicatai, Macrobiotus inermis) with their phylogenetic implications, while the redescription of two species is still in preparation (Astatumen trinacriae, Macrobiotus persimilis). The morphological description of four other species (Eremobiotus ginevrae, Macrobiotus euxinus, Minibiotus continuus, Paramacrobiotus centesimus) was updated through the study of type material preserved in the Pilato and Binda tardigradological collection, housed at the University of Catania. The fourth chapter is based on analyses conducted on a collection of substrates (belonging to Prof. G. Pilato) from old sampling campaigns; this collection includes fractions of the original samples from which species new to science were described at the time. By selecting these type locality samples, it was possible to re-extract and redescribe (with an integrated approach where possible) the pertinent species. Eleven samples were selected, revealing a total of 11 taxonomic entities, including four target species (Grevenius hydrogogianus, Hypsibius multituberculatus, Macrobiotus ragonesei, Minibiotus africanus) re-extracted from the "ancient" material for integrative redescription and phylogenetic analysis. Some data obtained from these species help address questions regarding the feasibility of studying material preserved dry or in alcohol for long periods. The fifth chapter presents data obtained through the revision of material from other collections, particularly the Rocha-Doma tardigradological collection, housed at the National University of La Pampa (Santa Rosa, Argentina), and the non-insect invertebrate collection housed at the "Centro de Colecciones Científicas" of the University of Magdalena (Santa Marta, Colombia). These analyses led to the compilation of species lists reported for Argentina and Colombia, the description of new and interesting species, and the further study of species of morphological and phylogenetic interest.

I tardigradi costituiscono un phylum di animali (Tardigrada Doyère, 1840) di dimensioni ridotte, che variano da circa 50 a circa 1000 µm, con attualmente quasi 1500 specie note (Degma & Guidetti, 2007, 2024; Guidetti & Bertolani, 2005). Si trovano ovunque sia presente almeno un velo d'acqua e sono quindi considerati animali acquatici. Possono essere trovati in ambienti marini (sedimenti, alghe, piante, etc.) o d'acqua dolce (alghe, sedimenti, etc.) e in substrati terrestri (briofite, licheni, suolo, lettiera, etc.). Questi animali presentano metameria, con un corpo costituito da cinque segmenti; il primo costituisce il capo, mentre gli altri quattro formano il tronco, ognuno dei quali possiede un paio di lobopodi. I lobopodi, o "zampe" ma senza vere articolazioni, terminano quasi sempre con unghie, o più raramente digitazioni (limitate ad alcuni tardigradi marini), di fondamentale importanza diagnostica. Lo studio dei tardigradi oggi è ancora fortemente influenzato da caratteristiche intrinseche di tali animali (un problema che era in passato acuito a causa di strumenti di studio meno avanzati e performanti), difficoltà derivanti da contributi scientifici passati molto lacunosi e parzialmente scorretti, e conoscenze limitate riguardo a certi aspetti dello studio su questi animali. Riguardo alle difficoltà intrinseche del gruppo, più ostacolanti in passato, possono essere citati principalmente i) le piccole dimensioni e la ii) presenza di un numero limitato di strutture sclerificate non deformabili (le cui misurazioni sono gli unici caratteri quantitativi con un margine di errore ridotto). Riguardo alle difficoltà moderne, che pongono ancora delle domande ai tardigradologi, vanno senz’altro citate: i) la mancanza di studi approfonditi sulla variabilità intraspecifica e interspecifica, attualmente disponibili solo per poche specie, e ii) la limitata conoscenza della ecologia, faunistica e biogeografia di questo gruppo animale. Inoltre, le seguenti difficoltà derivanti dagli studi passati influenzano ancora oggi la ricerca moderna: i) l'assenza o il deterioramento del materiale tipico per molte specie descritte in tempi passati, ii) le descrizioni delle specie passate effettuate solo con disegni e/o senza considerare i caratteri morfologici che ora sono diagnostici; ciò preclude un buon confronto con le specie descritte in passato, soprattutto se l'accesso al materiale tipo delle specie non è agevole. A causa di questi ultimi problemi, molte specie descritte in passato (utilizzando criteri tassonomici e strumenti ormai obsoleti) sono molto difficili da identificare con certezza. Sarebbe quindi necessario ottenere nuovi esemplari dai loci tipici delle specie per poterle ridescrivere secondo criteri moderni e con metodologie più complete e attuali, provvedendo in particolare ad un approccio integrato morfologico-genetico. Questo problema potrebbe sembrare meramente tassonomico e pertanto non è sempre considerato con la dovuta attenzione, ma va sottolineato che una corretta diagnosi specifica è essenziale per studiare e considerare un organismo in qualsiasi campo delle scienze biologiche. Pertanto, l'obiettivo principale delle presenti indagini sui tardigradi limno-terrestri è di contribuire a colmare queste lacune, a partire dal problema delle tecniche di studio fino alla tassonomia e sistematica delle entità specifiche tramite studi di descrizione e ridescrizione integrative, con, ove possibili, analisi filogenetiche. Tecniche di preparazione di animali e uova per analisi al SEM (Microscopia Elettronica a Scansione) sono state valutate e discusse, e sono state selezionate numerose specie target (da ridescrivere) descritte in passato, che sono state, ove possibile, analizzate e studiate con tecniche di studio moderne, quali PCM (Microscopia a Contrasto di Fase), SEM e analisi dei 4 marker molecolari più utilizzati per i tardigradi (marcatori ribosomali 18S, 28S e ITS2, ed il marcatore mitocondriale COI). Questa tesi di dottorato è composta da cinque capitoli principali: Il primo capitolo è una introduzione generale alle tematiche relative al progetto di dottorato, con una breve presentazione dello stesso e della presente tesi. Il secondo capitolo tratta delle indagini condotte e dei risultati ottenuti (talvolta collaterali) riguardo a determinate metodologie per lo studio dei tardigradi limno-terrestri; questo ha portato allo sviluppo di un nuovo protocollo, che richieda pochi materiali economici e di facile reperimento, di preparazione degli animali ai fini di analisi con SEM. Il terzo capitolo si concentra sui dati raccolti tramite lo studio dei substrati (muschio, licheni e lettiera) ricampionati in Sicilia in Loci Typici di specie descritte in passato per la Sicilia. Sono stati raccolti 61 campioni e rinvenute 35 entità tassonomiche. Un totale di 4 specie target, ovvero che necessitavano di essere ridescritte con metodi integrativi, sono state ritrovate; di queste, 2 sono state ridescritte (Eremobiotus alicatai, Macrobiotus inermis), con le implicazioni filogenetiche, mentre la ridescrizione di 2 specie è ancora in preparazione (Astatumen trinacriae, Macrobiotus persimilis); la descrizione morfologica di altre 4 specie Eremobiotus ginevrae, Macrobiotus euxinus, Minibiotus continuus, Paramacrobiotus centesimus) è stata aggiornata tramite lo studio del materiale tipo conservato presso la collezione tardigradologica Pilato e Binda, conservata presso l’Università degli Studi di Catania. Il quarto capitolo si basa su analisi condotte su una collezione di substrati (del prof. G. Pilato) provenienti da vecchie campagne di raccolta; tale collezione include frazioni dei campioni originali da cui a suo tempo erano state estratte e descritte specie nuove per la scienza. Selezionando quindi quei campioni di loci tipici, è stato possibile riestrarre e ridescrivere (con approccio integrato ove possibile) le specie di pertinenza. È stato possibile selezionare 11 campioni, rinvenendo in totale 11 entità tassonomiche di cui 4 specie target (Grevenius hydrogogianus, Hypsibius multituberculatus, Macrobiotus ragonesei, Minibiotus africanus) riestratte dal materiale “antico” ai fini di una ridescrizione integrativa e analisi filogenetica; alcuni dati ottenuti da queste specie permettono di rispondere ad alcuni interrogativi riguardo la possibilità di studiare materiale conservato secco o in alcool per lungo tempo. Il quinto capitolo presenta i dati ottenuti attraverso la revisione di materiale di altre collezioni, in particolare della collezione tardigradologica Rocha-Doma, conservata presso l’Università Nazionale de La Pampa (Santa Rosa, Argentina) e della collezione di invertebrati non-insetti conservata presso il “Centro de Colecciones Científicas” dell’Università del Magdalena (Santa Marta, Colombia). Queste analisi hanno portato alla redazione di liste di specie riportate per l’Argentina e per la Colombia, la descrizione di specie nuove per la scienza ed interessanti e l’approfondimento di specie interessanti da un punto di vista morfologico e filogenetico.